Cry2Aa基因优化设计及功能验证

摘要

原核生物苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白基因Cry2Aa不仅GC含量低,而且包含影响在真核生物中高效表达元件的结构,如果不加以改造而直接转入水稻中,不仅表达量低而且抗虫效果差.本研究首先通过同义密码子替换,提高了优化基因中GC含量和水稻(Oryza sativa L.)偏爱密码子的比例,消除原始基因中的Poly(A)加尾识别信号序列和内含子切割识别序列,然后在优化基因的5’端添加转运信号肽序列PRla和3’端添加内质网定位序列KDEL,采用Mfold软件优化mRNA二级结构,最终获得的优化基因Cry2Aa#的GC含量达到57.3％,碱基改变了25.87％,密码子改变了67.51％;消除了在真核生物中影响mRNA稳定的序列,密码子使用频率与水稻基因组基本保持一致;另外,消除了优化基因中存在的9个茎环等mRNA二级结构,其总自由能也相应降低,相比优化之前降低了23.9 kcal/mol.利用优化基因Cry2Aa#构建植物表达载体,转化水稻成熟胚诱导愈伤组织获得转基因植株,其分蘖期叶片中Cry2Aa#蛋白的表达量为8.62～18.88 μg/g鲜重,对稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)的抗性好,说明优化策略可行.本研究为外源基因优化设计提供重要参考数据,为水稻抗螟虫育种提供了优良抗虫基因资源.