α-银环蛇毒素基因的克隆及其非融合型原核表达

摘要

根据文献报道α-银环蛇毒素的氨基酸序列推导出其DNA序列,设计并人工合成两两互补的14条寡核苷酸片段.经片段延伸、PCR、克隆,成功构建α-银环蛇毒素基因克隆质粒;质粒经Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切回收后连接于表达载体pET28a(+)中,分别转化BL21(DE3)、BL21(DE3)Codon plus、BL21(DE3)plysS进行诱导表达,表达产物经Tris/tricine系统进行SDS-PAGE分析.结果表明:该基因已在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中进行了非融合表达,其表达量占细菌总蛋白的11.98%,主要以包涵体形式存在;同时对表达条件进行了优化,其表达量可达16.28%.经Western blot分析,在大约8 kDa处出现明显的目的带,与预计蛋白分子量大小一致,说明表达产物与天然α-银环蛇毒素具有相似的免疫原性.表达产物纯化、复性后经动物毒性试验表明:表达的α-银环蛇毒素蛋白具有生物学活性,小鼠腹腔注射其LD50约为1.28 μg/g.