美国白蛾核型多角体病毒ORF72原核表达载体的构建、表达及纯化

摘要

[目的]根据Ikdea对HycuNPV全基因组序列的分析,筛选出功能还未被研究的、保守性高的ORF72基因.[方法]将ORF72基因构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,对其进行诱导表达,优化表达的条件,并通过GST亲和层析色谱柱纯化融合蛋白.[结果]重组质粒pGEX-4T-1-ORF72的酶切检测以及测序结果均正确,证明重组质粒载体构建成功.通过SDS-PAGE凝胶电泳显示,ORF72蛋白能够与pGEX-4T-1载体上的GST标签蛋白进行融合表达,诱导表达后的融合蛋白大小约为38.2 kDa.优化后的表达条件为:异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导浓度为1.0 mmol·L-1,最佳诱导温度为25℃,最佳诱导时间为4h,并且该蛋白在大肠杆菌BL21和Rosetta表达菌株中均能很好的表达,但在Rosetta菌株中表达量更高.[结论]成功构建了pGEX-4T-1-ORF72原核表达载体,确定出ORF72融合蛋白最佳诱导表达条件,诱导表达并纯化出ORF72融合蛋白,为进一步研究其生物功能奠定基础.