重组融合蛋白大肠杆菌不对称合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸

摘要

将来自于Lactobacillus plantarum的突变D-乳酸脱氢酶(D-LDHY52V)和Candida boidinii的甲酸脱氢酶(FDH)进行融合,重组成双功能融合蛋白,为生物法合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸(D-PLA)提供新的方法.利用重叠延伸PCR技术,将对底物苯丙酮酸(PPA)亲合力更高的突变蛋白D-LDHY52V与FDH通过连接肽(Gly4Ser)3融合,将融合基因克隆至表达载体pET-28a(+),并转化Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导得到高效表达.SDS-PAGE电泳分析结果表明,融合蛋白分子质量为79.7 kDa,在重组菌中获得了正确表达;酶活性测定结果表明,融合蛋白具有D-LDH和FDH的双重生物学活性.在不对称转化PPA合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸(D-PLA)的应用中,融合蛋白体系比D-LDHY52V单独表达体系的D-PLA产量提高了40.71％.通过5h底物分批补加发酵,D-PLA产量为17.34 g/L,底物转化率为77.64％,生产强度3.47 g/(L·h).双功能融合蛋白增强了辅酶再生的效率,有效促进了(R)-2-羟基-3-苯基丙酸的不对称合成.