hnRNP K siRNA真核表达载体的构建及其在A549肺癌细胞中沉默效应的研究

摘要

目的构建hnRNP K特异性siRNA真核表达载体,体外观察对hnRNP K基因的沉默作用。方法采用基因克隆技术,将合成的特异性hnRNP K RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体pSUPER,构建hnRNP K siRNA真核表达载体。采用Lipofect AMINE2000将pSUPER空载体和3个重组质粒(pSUPER/hnRNP K siRNAa,pSUPER/hnRNP K siRNAc和pSUPER/siRNAn)分别导入A549肺癌细胞(a、c、n分别代表hnRNP K编码序列中的A链和C链,以及无意义的对照序列Non链)。24 h后用RT-PCR和Western blot技术检测各实验组肺癌细胞内hnRNP K mRNA及蛋白水平的表达情况。结果成功构建了hnRNP K siRNA真核表达载体。转染hnRNP K siRNAa、hnRNP K siRNAc的肺癌细胞24 h后hnRNP K mRNA相对表达量分别为0.24±0.53和0.28±0.57,较对照组显著降低(P均<0.01);hnRNP K蛋白灰度值分别为0.23±0.11和0.28±0.09,较对照组显著降低(P均<0.05)。结论构建的RNA干扰真核表达载体能明显干扰A549细胞hnRNP K mRNA及蛋白的表达,为进一步研究hnRNP K基因的功能并应用于肺癌的治疗研究奠定了基础。