ILKmRNA在结肠癌细胞株中的表达及其稳定表达的RNA干扰载体构建

摘要

[目的]检测结肠癌细胞株中ILK的mRNA水平,并构建针对ILK基因的特异性RNA干扰(RNAi)表达载体。[方法]通过RT-PCR检测ILK基因在三种结肠癌细胞株(SW480、LO-VO及HT29)mRNA的表达;根据GenBank提供的ILK基因mRNA序列,设计具有小发夹结构的两条DNA序列,化学合成后经退火形成双链DNA片段,连接到经HindⅢ/BglⅡ酶切线性化的pSUPER-neo-EGFP/H1(pSNE/H1)质粒上,形成重组载体pSNE-ILK,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切鉴定和测序鉴定,稳定转染结肠癌细胞HT29。[结果]①RT-PCR检测,ILK基因在三种结肠癌细胞株中均有表达,ILK/β-actin电泳条带强度比:SW480为0.63,HT29为0.65,LO-VO为0.33。②成功构建了针对ILK基因的特异性RNA干扰载体pSNE-ILK和对照的无关基因载体pSNE-Control,并稳定转染结肠癌细胞株HT-29。[结论]成功构建了针对ILK基因的特异性RNAi载体,并稳定转染HT29细胞,能有效抑制ILK基因,为下一步探讨ILK基因在结肠癌进程中的作用和结肠癌的基因治疗奠定了基础。