Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体及稳定表达的人神经母细胞瘤SH-SY5 Y细胞株的构建

摘要

目的 构建Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体,建立Sirt3基因稳定干扰的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞株.方法 从Genbank中检索到Sirt3基因序列,根据此序列设计Sirt3基因的4条siRNA干序列和1条阴性对照序列,将它们分别与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的线性化慢病毒载体连接,获得4种重组慢病毒质粒.将4种重组的干扰病毒质粒分别与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,测定病毒滴度.将4种构建的慢病毒载体感染SH-SY5Y细胞,采用Real-time PCR和Western blot检测Sirt3的沉默效果,筛选出最有效干扰Sirt3基因表达组.结果 测序证实成功构建了4种Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体,病毒滴度分别为:LV-SIRT3-RNAi-18×108 TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-23×108 TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-38×108 TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-48×108 TU/mL.与空白对照组(CON)和阴性对照组(NC)相比,LV-Sirt3-RNAi-3组mRNA表达水平及蛋白表达水平显著下降(P<0.001,P<0.001).结论 成功构建Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体,并筛选出最佳干扰序列组,获得稳定沉默Sirt3表达的SH-SY5Y细胞株,为后续研究Sirt3在帕金森病细胞模型中的作用奠定了基础.