Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的表达

摘要

目的构建Sirt3基因过表达慢病毒载体,通过稳定感染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立Sirt3基因过表达的SH-SY5Y细胞株,为研究Sirt3在帕金森病细胞模型中的作用提供新的方法。方法从GenBank中检索Sirt3基因序列,根据此序列设计并合成人Sirt3基因引物,扩增Sirt3基因的cDNA片段,将其克隆至慢病毒载体Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin中,构建慢病毒表达质粒。采用聚合酶链反应方法对阳性克隆进行鉴定和测序分析。将重组过表达病毒质粒及其2种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,测定病毒滴度。取对数生长期SH-SY5Y细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组和Sirt3组,空白对照组SH-SY5Y细胞仅加入普通培养基,阴性对照组SH-SY5Y细胞转染阴性对照病毒,Sirt3组SH-SY5Y细胞转染Sirt3过表达慢病毒。转染后加入嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞。使用实时荧光定量聚合酶链式反应和Western blot检测各组细胞中Sirt3mRNA和蛋白相对表达量。结果成功扩增Sirt3基因片段,大小1242bp;测序分析结果显示,过表达慢病毒Sirt3与GenBank中Sirt3基因序列完全一致,病毒滴度为1.2×10^12TU·L^-1。Sirt3组细胞中Sirt3 mRNA和蛋白相对表达量显著高于空白对照组和阴性对照组(P0.05)。结论Sirt3基因过表达慢病毒载体可成功构建,并获得稳定表达Sirt3基因的SH-SY5Y细胞株。