人宫颈癌基因RNA干扰真核表达载体的构建及其稳定转染胰腺癌细胞株的建立

摘要

目的:构建针对人宫颈癌基因2(HCCR2)有效靶点的RNA干扰真核表达载体,鉴定获得干扰质粒稳定转染的人胰腺癌PANC1细胞株.方法:设计并合成多个针对HCCR2基因的RNA干扰序列,并将其插入真核表达慢病毒载体pGCsi-H1/Hygro/NEGative,通过测序和与HCCR过表达载体共转染293T细胞后行Western blot检测,筛选出有效干扰质粒;通过脂质体转染法将该有效干扰质粒pGCsi-HCCR2稳定转染至人胰腺癌细胞株PANC1.抗生素G418筛选获得稳转细胞株;Western blot检测稳转细胞株中HCCR2蛋白表达水平.结果:HCCR2干扰载体和过表达载体共转染293T细胞后Western blot检测结果表明干扰质粒3具有最佳干扰效果,选其作为最终干扰质粒.将该质粒稳定转染至胰腺癌PANC1细胞后,Western blot检测显示,干扰组的PANC1细胞株与空载体组比较,HCCR2蛋白表达水平下调,表明获得HCCR2的RNA干扰质粒稳定转染的PANC1细胞株.结论:成功构建了HCCR2的RNA干扰真核表达载体及其稳定转染的人胰腺癌PANC1细胞株.