基于二代测序技术建立覆盖我国主要流行亚型的HIV-1近全长基因组测序方法

摘要

目的 基于二代测序技术建立一种适合我国主要流行亚型的HIV-1近全长基因组扩增和测序方法,并优化建立标准检测流程,为HIV-1的全基因组序列鉴定和相关系统进化分析等应用提供重要技术手段。方法 基于我国HIV-1主要流行亚型设计扩增引物,通过扩增两段交叉重叠的基因序列获得HIV-1近全长基因组。并通过使用不同反转录试剂与扩增试剂以及尝试不同反应体系和反应条件,分析对HIV-1近全长基因组扩增的效果以及进行二代测序所获序列质量的影响。结果 本研究基于二代测序技术建立的HIV-1近全长基因组扩增和测序方法可成功扩增我国主要HIV-1流行亚型CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B、CRF55_01B,进行二代测序所获基因组序列的平均比对率为95.18%(89.74%~99.16%),平均覆盖率为94.96%(83.58%~99.98%),平均测序深度为5323.10×(3026.68×~6790.57×)。进一步分析不同亚型毒株每个基因位点的测序深度覆盖图,发现CRF08_BC亚型与CRF105_0108亚型的毒株测序深度分布均匀,均高于6000×,其他亚型的毒株样本在6672~8196 bp之间有部分基因位点的测序深度较低。优化和建立的标准检测流程可成功扩增病毒载量大于104copies/mL的样本并获得准确的近全长基因组序列。结论 本研究基于二代测序技术建立了一种HIV-1近全长基因组扩增与测序方法,该方法可成功扩增我国主要流行亚型毒株,为我国应用HIV-1基因组序列开展艾滋病精准防控工作提供了重要技术支撑。