Tet-on系统诱导COX1基因在小鼠前脂肪细胞3T3-L1中的表达

摘要

目的利用Tet-On诱导表达系统,调控目的基因环氧化酶(COX)的表达,探讨COX对脂肪细胞分化的作用,为进一步深入研究肥胖的致病机制奠定理论基础。方法脂质体介导调控质粒pTet-On转染3T3-L1细胞,G418筛选单细胞克隆,RT-PCR法检测四环素反应转录活化因子(rtTA)基因的整合;pTRE-Tight-Luc质粒瞬时转染含rtTA基因的细胞克隆,强力霉素(DOX)诱导表达后检测荧光素酶活性,筛选出高效表达的抗性克隆,命名为3T3-L1-Tet-On-26#;构建重组质粒pTRE-Tight-COX1,双酶切鉴定后测序,将测序正确的重组质粒瞬时转染3T3-L1-Tet-On-26#细胞克隆,免疫荧光检测COX1的表达。结果建立了3T3-L1-Tet-On细胞模型;成功构建了pTRE-Tight-COX1重组质粒,瞬时转染3T3-L1-Tet-On-26#,DOX诱导后COX1表达显著升高。结论诱导表达细胞株3T3-L1-Tet-On的建立为COX1功能基因的研究提供了平台。