小麦RNA解旋酶基因TaDEAD1-B的原核表达、纯化及解旋酶功能验证

摘要

RNA解旋酶(RNA helicase)参与多种逆境胁迫应答,是重要的抗逆候选基因。本研究成功从小白麦(Triticum aestivum)中克隆了一个参与干旱、高温胁迫响应的DEAD-boxRNA解旋酶基因TaDEAD1-B的CDS全长序列并对其在逆境胁迫的表达模式进行了分析。进而将TaDEAD1-B基因的编码区构建到原核表达载体pColdTMTF,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)菌株后,对其最优原核表达条件(异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导浓度、培养温度和时间进行了分析。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对重组蛋白pColdTMTF-TaDEAD1-B的可溶性进行了研究,进而利用磁珠法对重组蛋白进行了分离纯化;最后利用甲醛变性凝胶(Formaldehy dedenaturedgel)电泳法验证了TaDEAD1-B的解旋酶功能。结果表明,TaDEAD1-B的cDNA(GenBank登录号:MG888432)含有68bp的5'UTR,1905bp的基因编码区和79bp的3'UTR,编码634个氨基酸;理论分子量为67.06kD,理论等电点pI7.69。干旱胁迫和高温胁迫下的表达分析表明TaDEAD1-B的表达量分别在胁迫后6h和4h达到最高峰值,组织特异性表达分析表明TaDEAD1-B在生殖器官小穗中优势表达。重组蛋白pColdTMTF-TaDEAD1-B的最佳诱导表达条件为IPTG(1.0mmol/L),16℃,150r/min诱导16h,且重组蛋白是可溶的。甲醛变性凝胶电泳证明TaDEAD1-B蛋白具有ATP依赖型RNA解旋酶活性。逆境胁迫和组织表达模式分析以及其解旋酶功能验证为研究TaDEAD1-B在小麦中的生物学功能提供了理论参考。