登革病毒非结构蛋白NS3 NTPase/RNA解旋酶结构域的原核表达、活性研究及拮抗肽筛选

摘要

登革病毒(denguevirus)是人类登革热(DF)、登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)的病原体。登革病毒感染严重威胁全球近半数人的健康，然而时至今日仍然没有有效的治疗药物和疫苗，因而探索抗登革病毒感染的新策略成为当今登革研究的热点。登革病毒非结构蛋白NS3，其编码基因在黄病毒中具有高度的保守性，基因全长1854bp,编码618个氨基酸，是病毒编码的第二大蛋白。NS3是一种多功能蛋白，N端具有Ser蛋白酶活性，C端具RNA解旋酶及NTPase、5′RNA三磷酸酶等活性，参与病毒前体的加工和病毒RNA的复制及基因组RNA的5′端加帽。该蛋白具有很好的免疫原性，并存在特异性CD4+和CD8+识别表位，可诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。鉴于NS3同时具有病毒复制所必需的多种酶活性及其良好的免疫原性，其已成为登革抗病毒药物设计的重要靶标。本研究工作分为以下三个部分： 1)DENNS3表达体系的构建：提取感染登革2型病毒的C6/36细胞总RNA，RT-PCR扩增目的基因，双酶切后连入表达载体，构建重组表达载体pET32a-NS3、pET28a-dNS3，转化宿主菌BL21(DE3)，IPTG诱导，SDS-PAGE和免疫印迹鉴定表达蛋白。通过优化诱导表达条件，NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域(dNS3)在大肠杆菌中获得可溶性表达。 2)重组蛋白NTPase活性和抗原性分析：表达产物经亲和层析纯化，超滤浓缩脱盐，孔雀绿钼酸铵法检测NTPase活性。纯化产物经测定具有良好的NTPase活性及抗原性，dNS3对其底物(ATP、CTP、GTP、UTP)存在不同的底物亲嗜性。体外条件下，发现登革2型病毒非结构蛋白NS5(RDRP)及polyA对dNS3的ATPase活性有促进作用，提示在病毒复制时，NS3与NS5间的相互作用可能对NS3的NTPase活性有调控作用。 3)NS3蛋白小分子结合肽的筛选：以NS3蛋白为配体，从噬菌体随机多肽文库中，筛选出能与NS3蛋白NTPase/RNAhelicase结构域特异性结合的短肽分子，进行了3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选。从第3轮筛选后得到的噬斑中随机挑选20个克隆，用ELISA法测定上清液中噬菌体与DEN-2dNS3结合活性。其中有8株ELISA的吸光度值较高。 从筛选得到的阳性克隆菌株提取单链DNA，进行DNA序列测定并推导这些DNA序列编码的氨基酸残基，即为噬菌体递呈的肽序列。本实验筛选得到肽氨基酸序列大多含有TPS/SPT序列，富含丝氨酸、苏氨酸等亲水性氨基酸。实验所用ELISA反应可用于半定量的测定噬菌体克隆和靶分子之间的结合能力，要真正地确定所淘选到的多肽是否具有特异结合活性，是否能作为药物，还要在人工合成多肽之后进行细胞、组织、动物体等一系列水平上的进一步测定。

目录

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分登革2型病毒NS3蛋白在原核细胞中的可溶性表达

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论

第二部分NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域NTPase活性及抗原性分析

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论

第三部分NS3蛋白NTPase/RNA helicase结构域小分子配体的筛选

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论

总结

参考文献

文献综述 登革病毒非结构蛋白NS3研究进展

致谢