真核表达载体pcDNA3-CTLA4lg的构建及体内表达

摘要

背景:CTLA-4lg的制备过程比较复杂,单克隆抗体的价格比较昂贵,而且应用CTLA-4lg单克隆抗体注射本身存在着血浆药物浓度不稳定的问题。目的:探讨Ctla4lg表达质粒构建的可行性。设计、时间及地点:基因水平观察实验,于2005/2006在中国医科大学中心实验室完成。材料:雄性Wistar大鼠10只,近交系昆明小鼠10只。方法:提取Wistar大鼠总RNA,反转录成cDNA第1链,PCR扩增CTLA4基因,将其和真核表达载体pcDNA3酶切、连接。转化感受态菌DH5α,培养后挑取阳性克隆、提取质粒,酶切鉴定重组子、测序,最后转染近交系昆明小鼠,应用Westen Blot法检测血清CTLA4lg水平。主要观察指标:构建的Ctla4lg表达质粒基因序是否正确以及能否在小鼠体内进行蛋白表达。结果:对含有pcDNA3-CTLA4质粒的LB菌液进行鉴定测序,目的基因片断大小为288bp,与Genebank上公布的CTLA4序列完全一致,质粒构建正确。利用阳性脂质体载体包被pcDNA3-CTLA4lg转染小鼠,有3只在第7天血清检测CTLA4Ig阳性,显示pcDNA3-CTLA4lg能够在鼠肌细胞内表达。结论:利用基因合成和重组技术成功构建了真核表达载体pcDNA3-CTLA4Ig,利用脂质体法成功的将pcDNA3-CTLA4lg转染到鼠肌细胞内并进行表达。