兔膝关节软骨单位体外酶解法消化分离的实验研究

摘要

目的 探讨兔膝关节软骨单位(chondron)体外酶解法消化、分离的可行性及实验方法.方法 2月龄新西兰白兔8只,随机分为2组,各4只.无菌条件下剖取双膝关节全层软骨,一组采用常规0.4%Pronase酶和0.025%Ⅱ型胶原酶依次消化为软骨细胞;另一组采用0.3%dispase酶和0.2%Ⅱ型胶原酶联合搅拌消化3 h为软骨单位.利用倒置显微镜观察、细胞爬片苏木素-伊红(HE)和Ⅵ型胶原免疫荧光染色以及微系统测试分析仪进行软骨细胞及单位形态学分析,Annexin-V/PI流式细胞术检测软骨细胞及单位早期凋亡率.结果 倒置显微镜下软骨单位主要由1或几个串珠状细胞形态构成,透亮程度较差;而软骨细胞均表现为单一透亮的圆形细胞形态.软骨细胞HE染色呈爬片形态,胞质膨松透亮;软骨单位细胞周围存在一层淡染基质成分,且Ⅵ型胶原免疫荧光染色强阳性表达,界限清晰,可见大量由其包裹1、2、3或4个软骨细胞的单位形态.微系统分析仪下软骨单位由高到低均分为细胞核、细胞质及PGM三层结构,每一层梯度高度约0.4μm.急性消化软骨细胞和单位在活细胞率、早期及晚期凋亡率方面差异无统计学意义.结论 0.3%dispase酶和0.2%Ⅱ型胶原酶联合搅拌消化3 h可以成功获取兔膝关节软骨单位,为其体外进一步研究奠定基础.