应用巢式RT-PCR结合RFLP、SSCP对山东肾综合征出血热病人血清中HV基因检测和分型研究

摘要

目的探讨山东肾综合征出血热重疫区病人血清中HV分子生物学特征,同时寻找准确、简便、迅速的HV检测与分型方法,从而为制定防治决策提供科学根据.方法从山东肾综合征出血热重疫区临沂市费县收集病人早期血清,应用巢式RT-PCR对病人血清中的HV进行基因扩增,采用RFLP、SSCP分型,并进行序列测定与分析.结果 48份临床和ELISA检测确诊的HFRS病人血清经巢式RT-PCR扩增后,41份阳性,阳性率85.42%.41份阳性标本巢式RT-PCR产物经Hind Ⅲ、HinfⅠ酶切后,呈现2种不同的RFLP图谱:33份显示与R22株相似的酶切图谱,应属SEOV型;另外8份显示出与HTN 76-118株相似的图谱,属HTNV型,这8份HTNV型标本均为10-12月间收集的病人血清.41份阳性标本巢式RT-PCR产物经SSCP分析,亦呈现2种不同的图谱:33份具有与R22株相似的SSCP图谱,应属SEOV型;而另8份则与HTN 76-118株具有相似的SSCP图谱,属HTNV型.对部分扩增产物序列采用系统进化树分析也得出类似的结果:sdp1、sdp2、sdp3与HTN型76-118株亲缘关系相近,属同一簇,而sdp22、sdp37与SEOV型Z37、R22株亲缘关系相近,属另外一簇,这与RFLP和SSCP获得的结果相一致.结论山东肾综合征出血热重疫区病人基因型以SEOV型为主,但在秋冬季节也存在HTNV型.巢式RT-PCR结合RFLP、SSCP法可对HV准确分型,而且简便、迅速,适合于大规模流行病学调查.