牛分枝杆菌ESAT-6-CFP-10融合基因重组腺病毒载体的构建及表达

摘要

目的 构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础.方法 以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板 ,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE) 将ESAT-6和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到融合基因.将融合基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-CFP-10,限制性内切酶消化、菌液PCR、序列分析验证无误后,Pme Ⅰ酶切,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-ESAT-6-CFP-10.Pac I酶切线性化的重组质粒pAd-CMV- ESAT-6-CFP-10转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增.PCR、Western blot检测包装病毒的融合基因及其表达情况.结果 成功构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,包装病毒用PCR、Western blot检测到包装病毒的融合基因及其表达.结论 本研究成功地构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒,为下一步在动物体内进行免疫效果研究打下基础.