人G1型轮状病毒TaqMan荧光定量检测方法的建立与应用

摘要

目的 本研究旨在建立一种快速准确定量检测人G1型轮状病毒的TaqMan探针荧光实时PCR检测方法.方法 以轮状病毒VP6基因为靶基因,分别设计2对引物及其相应的TaqMan探针,扩增目的片段,将目的片段克隆于PCD-NA3.1+载体上,体外转录获得RNA,系列稀释后为标准品,建立TaqMan探针荧光定量实时PCR检测方法并对该方法进行验证.结果 设计实验找到最优条件下的引物浓度(250 nmol/L)、探针浓度(300 nmol/L);通过对引起腹泻的人柯萨奇病毒、呼肠孤病毒等进行检测,结果均为阴性,表明该方法具有很好的特异性.该方法的最低检测量为5 copies/μL.对该方法进行重复性实验,发现变异率均小于1％,重复性好.用已建立的方法对4份粪便临床样品进行3次重复试验,病毒RNA的检出率为100％.结论 本实验初步建立了人G1型轮状病毒TaqMan探针荧光实时PCR检测方法,为G1型轮状病毒的诊断、检测和分子流行病学研究提供了一种新的方法.