G9型猪轮状病毒TaqMan荧光定量Rt-PCR检测方法的建立及初步应用

摘要

轮状病毒属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)成员，是病毒性腹泻的主要病原，多感染婴幼儿及多种幼龄动物。对于仔猪来说，轮状病毒的致病力极高，特别是7日龄以内的仔猪，死亡率接近100％。轮状病毒的潜伏期短，传染性强，一旦有猪只感染，则会迅速传播，引起轮状病毒的大规模暴发，给养猪产业带来巨大的经济损失。现阶段对于轮状病毒的检测主要依靠常规RT-PCR方法，但该方法灵敏性较低，较难用于早期诊断和微量检测。而荧光定量RT-PCR方法恰好弥补了这一缺陷，一般来说，定量RT-PCR方法较常规RT-PCR方法敏感性高约100-1000倍，适应于感染早期的微量诊断，为及早防控轮状病毒的暴发并将损失降到最低提供科学数据。
　　本试验旨在建立一种灵敏、特异的G9型猪轮状病毒(PoRV) TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，为轮状病毒的临床诊断提供有效的技术手段。根据GenBank中登录的PoRV（G9型）NMTL株的VP7基因保守区域设计了特异的引物和探针。通过对引物探针使用浓度、退火温度等条件进行优化，以常规RT-PCR扩增的VP7基因片段与pMD18-T载体进行连接构建的阳性重组质粒进行10倍系列稀释作为标准品，建立了G9型轮状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，并评价了该方法的特异性、灵敏性和重复性。通过建立标准曲线，可知初始模板拷贝数的对数与Ct值之间呈现一定的线性关系，直线方程为Y=-3.436X+41.70，相关系数达到0.991。此方法可检测的最低浓度为33.6copies/μL，与常规RT-PCR检测方法相比，灵敏度高约1000倍。该方法对其它常见的PoRV(G5)、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性，表明该方法具有良好的特异性。研究结果表明，该方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点，可以对轮状病毒感染早期猪只体内的轮状病毒做出准确的判断和定量，进而对预防轮状病毒的大规模爆发起到了重要的作用。
　　用PoRV NMTL分离株对3日龄健康新生仔猪进行攻毒试验，此毒株的TCID50为10-4.5/0.1mL。选取8头仔猪，将其分为攻毒组和对照组，每组4头，攻毒组口服5×105 TCID50病毒细胞培养液，将攻毒组与对照组分开饲养。研究结果显示，攻毒后8h有一头仔猪发生腹泻症状，随着时间的推移，出现腹泻的仔猪数量增加，表现为呕吐、脱水、消瘦等症状，粪便为黄色水样，精神萎靡。最早死亡的仔猪是在攻毒后36h，死亡时脱水症状明显，身体呈现紫青色。利用建立的G9型猪轮状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法检测攻毒后每12h采集的肛拭子样品，结果表明，随着攻毒时间的增加病毒拷贝数也在不断增加，在攻毒后60h-84h病毒拷贝数达到最高值。病理组织学分析发现攻毒组仔猪的小肠出现严重的病变:十二指肠、空肠、回肠都有明显的萎缩变粗;绒毛上皮细胞坏死、脱落;绒毛近黏膜处黏膜上皮细胞空泡化;固有层出现水肿，而对照组仔猪没有明显的病理变化。
　　本研究为轮状病毒的临床诊断工作提供了有效的技术支持，为轮状病毒疫苗的研究开发及其致病机理的研究提供了物质基础和理论依据。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 轮状病毒概述

1．1．1 轮状病毒的形态、结构及基因组

1．1．2 轮状病毒的理化特性和培养特性

1．1．3 轮状病毒的主要结构蛋白及其功能

1．1．4 轮状病毒的非结构蛋白及其功能

1．1．5 轮状病毒的致病机理

1．1．6 轮状病毒的流行病学

1．1．7 轮状病毒感染的临床表现及病理变化

1．2 轮状病毒的检测技术

1．2．1 病原学检测技术

1．2．2 血清学和免疫学检测技术

1．2．3 分子生物学检测技术

1．3 荧光定量PCR的原理

1．4 定量PCR反应中的荧光化学

1．4．1 非特异性DNA结合染料

1．4．2 TaqMan探针

1．4．3 分子信标

1．4．4 杂交探针

1．4．5 复合探针

1．5 荧光定量PCR技术的应用

1．5．1 荧光定量PCR技术在病原微生物检测方面的应用

1．5．2 荧光定量PCR技术在细胞因子基因表达定量检测上的应用

1．5．3 荧光定量PCR技术在肿瘤研究中的应用

1．6 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 病毒、细胞及临床病料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 PoRV的培养

2．2．3 病毒半数组织感染量(TCID50)的测定

2．2．4 病毒核酸的提取

2．2．5 阳性标准质粒的制备

2．2．6 荧光定量RT-PCR标准曲线的建立

2．2．7 特异性试验

2．2．8 敏感性试验

2．2．9 重复性试验

2．2．10 临床样品检测

2．2．11 人工动物感染试验

2．2．12 应用荧光定量PCR方法检测仔猪排毒情况

2．2．13 组织切片的制备

2．2．14 染色

3 结果与分析

3．1 PoRV TCID50的测定结果

3．2 标准质粒的制备

3．3 荧光定量PCR标准曲线的建立

3．4 特异性试验结果

3．5 敏感性试验结果

3．6 重复性试验结果

3．7 临床样品检测结果

3．8 人工动物感染试验结果

3．8．1 临床症状表现

3．8．2 解剖病变

3．8．3 荧光定量RT-PCR检测仔猪粪便排毒量

3．8．4 病理学检测

4 讨论

4．1 荧光定量PCR技术讨论

4．2 仔猪感染轮状病毒排毒规律的讨论

4．3 猪轮状病毒致病特性研究

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文