猪轮状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

摘要

猪轮状病毒感染(Porcine rotavirus，PoRV)是一种严重的接触性肠道传染病，导致仔猪出现呕吐、腹泻、脱水和消瘦等临床症状，也能够致使仔猪死亡，特别是对7日龄左右的仔猪造成的危害最为严重。该病主要暴发于寒冷时期的冬季以及早春时节，且传播迅速，给养猪产业带来巨大的损失。现阶段实验室对PoRV病原的检测主要是利用常规RT-PCR方法，但是常规RT-PCR方法相对于荧光定量RT-PCR灵敏度较低。常规RT-PCR只能检测到发病严重时期的猪只，对轮状病毒感染早期的猪只，则需要灵敏度更高的检测方法来实现，以达到在猪感染的潜伏期就可以诊断并采取有效的防控措施来减少PoRV的暴发带来的损失。
　　 本试验主要是为临床检测PoRV建立灵敏性更高的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。根据GenBank中登录的A群猪轮状病毒(PoRV)TM-a毒株序列，我们针对结构蛋白VP6基因设计了一对常规RT-PCR特异性引物和一对荧光定量RT-PCR特异性引物和探针，将通过常规RT-PCR扩增VP6获得的目的片段与pMD-18T载体连接构建标准阳性质粒，建立了检测A群PoRV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法，并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评价。通过荧光定量RT-PCR反应获得的标准曲线可知，反应中模板DNA的量与荧光定量RT-PCR的CT值呈一定的线性关系，且得其直线方程是y=-3.979gx+43.152，相关系数达到0.997。此方法可以检测出最低的PoRV的cDNA浓度为4.6×102 copies/μL。在跟常规RT-PCR检测方法进行对比后得知，新方法的敏感度要比常规RT-PCR方法高100倍。用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV2)均为阴性。研究结果表明，该方法敏感性高、特异性强、重复性好，因此对猪群的早期感染体内低病毒拷贝数时都能做出准确的判断，对防治PoRV的暴发能够起到重要作用。
　　 用本实验室分离的猪轮状病毒TM-a毒株对三日龄仔猪进行攻毒试验，此毒株的TCID50为10-6.58/0.1ml，用新建立的荧光定量RT-PCR方法测得病毒液的病毒拷贝数为1.8×106 copies/μL。选取PoRV阴性的16头三日龄仔猪，分成4组:空白对照组，口服4×106 TCID50的低剂量组，口服2×107 TCID50的中剂量组，口服1×108 TCID50的高剂量组。本研究成功地复制出了轮状病毒感染仔猪的病理模型:高、中、低剂量组分别于第12h、18h、30h采集的粪拭子开始检测到病毒，并且分别于36h、48h、60h开始出现腹泻、呕吐、脱水等症状;通过荧光定量RT-PCR方法检测试验仔猪攻毒后每隔6h的粪拭子PoRV拷贝数，探索猪感染PoRV后的排毒规律，结果表明，随着时间的延长粪样中的病原拷贝数也增加，并且在96h达到峰值1.8×107copies/μL;通过病理组织切片HE染色发现，攻毒组小肠出现严重病变，肠绒毛萎缩变短或脱落，空白对照组无明显变化;同时应用免疫组化法发现病毒主要集中在小肠粘膜上皮和固有层内，尤其以十二指肠段最多。以上研究工作为今后进行PoRV病原诊断试剂的研发、新疫苗的研制和疫苗效果的评价提供了一定的理论依据和物质基础。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

1 文献综述

1．1 轮状病毒的历史

1．2 轮状病毒的形态、结构和基因组

1．3 轮状病毒的理化特性和培养特性

1．4 轮状病毒的流行病学

1．5 轮状病毒感染的临床症状和病理变化

1．6 轮状病毒的诊断方法研究进展

1．7 轮状病毒感染的免疫机制

1．7．1 局部黏膜免疫保护机制

1．7．2 体液免疫

1．7．3 细胞免疫

1．7．4 其他非免疫机制

1．8 荧光定量RT-PCR原理与应用

1．8．1 定量原理

1．8．2 FQ-PCR反应方法的分类

1．8．3 实时荧光定量PCR的应用

2 研究的目的与意义

3 材料与方法

3．1 材料

3．1．1 病毒、细胞及临床病料

3．1．2 试验动物

3．1．3 主要仪器

3．1．4 主要试剂和药品

3．1．5 主要培养基的配置

3．2 试验方法

3．2．1 引物与探针的设计

3．2．2 病毒核酸的提取

3．2．3 阳性标准质粒的制备

3．2．4 实时定量RT-PCR反应体系的建立

3．2．5 标准曲线的制备

3．2．6 特异性试验

3．2．7 敏感性试验

3．2．8 重复性试验

3．2．9 临床病例的检测

3．2．10 PoRV细胞培养物的检测

3．2．11 人工动物试验

3．2．12 实时荧光定量RT-PCR

3．2．13 组织切片制备

3．2．14 HE染色

3．2．15 免疫组化法检测试验猪的病毒含量情况

4 结果与分析

4．1 标准质粒的制备

4．2 荧光定量RT-PCR反应体系的建立及标准曲线的制备

4．3 特异性试验

4．4 敏感性试验

4．5 重复性试验

4．6 临床病例的检测

4．7 PoRV细胞培养物中病毒载量的检测

4．8人工动物试验

4．9 荧光定量RT-PCR检测人工感染猪粪便排毒量

4．10 病理学检测

4．10．1 HE染色检测

4．10．2 免疫组化法对病毒的检测

5 讨论

5．1 荧光定量PCR技术讨论

5．2 猪轮状病毒致病特性

5．3 猪轮状病毒的排毒规律探讨

5．4 试验中需要注意的问题

6．结论

参考文献

致谢