猪轮状病毒(G9型)TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

摘要

为建立灵敏、特异的G9型猪轮状病毒(PoRV) TaqMan的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的G9型PoRV NMTL株的VP7基因保守区域设计一条特异性引物和探针.以104 TCID50的病毒液所提取的总RNA进行10倍系列稀释作为标准品,通过对反应条件进行优化,建立了检测G9型PoRV的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法.结果显示,该方法的相关系数R2=0.991,对其它常见的PoRV(G5)、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性,具有良好的特异性;该方法最低可以检测到的病毒滴度为10-3 TCID50,比普通RT-PCR方法灵敏度高约1 000倍;组内和组间变异系数均小于0.87％,稳定性高,重复性好.对疑似感染PoRV的45份临床病料样品进行检测,结果表明,该方法阳性率(64.4％)高于普通RT-PCR (44.4％),两者总符合率为80％.本研究建立的方法为PoRV的流行病学调查和早期诊断奠定基础.