敖汉细毛羊Hoxa5基因质粒的构建及在成纤维细胞中表达量的研究

摘要

本研究旨在构建敖汉细毛羊Hoxa5基因的质粒及转染成纤维细胞后基因的表达量变化.试验以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊.首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照GenBank中Hoxa5基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得Hoxa5基因片段、将得到的Hoxa5基因连接到pGM-T载体,构建pGM-T-Hoxa5重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli DH5α感受态细胞提取质粒进行酶切鉴定.鉴定正确后构建pcDNA3.1-Hoxa5重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的质粒pcDNA3.1-Hoxa5转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Hoxa5基因在成纤维细胞中表达量的变化.结果显示,经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3.1-Hoxa5构建成功,并且转染成纤维细胞后Hoxa5基因的表达量明显升高,且转染组的表达量显著地高于对照组(P＜0.05).表明:成功构建了敖汉细毛羊Hoxa5基因的质粒,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础.