不同分离方法对鼠胚胎成纤维细胞生长影响的比较

摘要

目的:采用组织块培养法、单细胞悬液法、滤网过滤改良法分离培养鼠胚胎成纤维细胞,比较不同分离方法对其生长形态、生长曲线及细胞周期的影响。方法:实验于2006-03/09在辽宁医学院解剖实验室完成。①选取清洁级昆明种七八周龄雄性小鼠10只,4周龄雌性小鼠20只,雄雌鼠按1∶2合笼,次日晨检查有阴栓者记为孕0.5d,选择孕12.5～14.5d雌鼠断颈处死,取出胎鼠,去除胚胎头部、内脏和四肢,将躯干部用无菌眼科剪剪成1mm3以下的碎块,分别用以下方法进行分离培养。②组织块培养法:将剪碎的组织块吸置于离心管内,加入1mL消化液(含2.5g/L胰蛋白酶和0.4g/L乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液),吹吸30s,加入等体积的完全培养基(含体积分数为0.1的胎牛血清)终止消化,弃上清液,留下鼠胚组织块沉淀物,按相互距离0.5cm放入培养瓶内,培养箱静置2～4h后,加入适量完全培养基,3d换液一次。③单细胞悬液法:将剪碎的组织块加入1mL消化液,吹打30s,室温下静置3～5min,吸取上层液体,再加入消化液,重复上述操作五六次,最后弃组织块,将收集的上层液离心,1000r/min离心5min,弃上清液,加入完全培养基5mL,吹打均匀后吸至培养瓶内培养。培养条件、换液时间与组织块培养法相同。④滤网过滤改良法:将剪碎的组织块加入1mL消化液,吹打30s,37℃水溶箱中轻摇3～5min,加入完全培养基1mL终止消化,室温下静置1.0～2.0min,用直径5cm、孔径为150目滤网过滤后,将过滤液以1000r/min离心5min;弃上清液,加入适量完全培养基,轻吹30～50下,吸至培养瓶内,37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养24h,半量换液,以后3d换液一次。⑤检测不同分离方法对鼠胚胎成纤维细胞生长形态、生长曲线及细胞周期的影响。结果:①鼠胚胎成纤维细胞生长形态观察:组织块培养法第2天可见少量成纤维细胞,细胞生长缓慢,需要七八天才能传代。单细胞悬液法第2天可见成纤维细胞生长,细胞量虽多,但死亡的细胞也较多,细胞活力减弱,四五天后传代。滤网过滤改良法第2天可见成纤维细胞呈长梭形,胞浆饱满,细胞生长迅速,三四天长满培养瓶,三四天传代。②细胞生长曲线检测:组织块培养法培养的细胞第4～8天进入对数生长期,单细胞悬液法培养的细胞第3～5天进入对数生长期,滤网过滤改良法培养的细胞第2～4天进入对数生长期。③细胞周期检测与增殖指数:培养第3天,滤网过滤改良法所得的鼠胚胎成纤维细胞增殖指数最高,达到54.12%,单细胞悬液法、组织块培养法细胞增殖指数分别为53.52%和53.15%,3种方法差异无显著性意义(P>0.05),表明其细胞周期基本相同。结论:滤网过滤改良法可以在较短时间内培养出优质高采的鼠胚胎成纤维细胞。