不同转座子在猪和鼠胎儿成纤维细胞中转座活性的比较研究

摘要

转座子(Transposon，Tn)，是染色体上可自主复制和移位的基本单位，普遍存在生物体基因组内，转座子从一个基因位点插入到另一个基因位点的过程称为转座。Sleeping beauty(SB)、piggyBack(PB)、Tol2是目前研究应用较多的3种DNA转座子。为了探讨此3个转座子系统的转座特性，本研究将含转座元件的重组表达载体转染哺乳动物猪和小鼠胎儿成纤维细胞（PEF和MEF），通过优化相关参数，系统比较了转座活性差异，为转基因和功能基因捕获研究提供重要参考。本实验主要包括:
　　1.用高保真PCR法克隆绿色荧光蛋白eGFP编码区，经序列测定正确后，亚克隆至载体pGL3-SV40启动子下游，然后将SV40-EGFP表达框克隆至SB转座子载体pT2-HB，构建成转座子表达载体，命名为pT2-SV40-EGFP。将此重组质粒经脂质体Lipo-fectamineTM2000包裹转染猪胎儿成纤维细胞(PEF)，48小时后通过荧光显微镜观察报告基因的表达。结果表明，PEF细胞转染率较高（大于50％），且PT2-SV40-EGFP能有效表达。提示Lipo-fectamineTM2000可高效包裹转座子载体转染胎儿成纤维细胞，为后继实验提供参考。
　　2.用分子克隆方法将PB和Tol2转座元件克隆至pT2-HB，从而构建成含三种转座子的重组载体，命名为pT3-PST;再用内切酶将CAG-GFP表达盒从载体pCAG-GFP中切出，亚克隆至pT3-PST，构建成表GFP的多转座子载体，命名为pT3-PST-CAG-GFP载体。将此重组载体用上述方法转染猪胎儿成纤维细胞(PEF)和小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)，结果表明，pT3-PST-CAG-GFP载体在两种细胞中均能有效转染和表达，提示该载体构建成功，可用于转座特性研究。
　　3.为了比较SB11、SB16、SB100x三种转座酶的转座活性，按照DNA质量比10∶1比例将pT3-PST-CAG-GFP和表达上述三种转座酶的载体分别混合，经脂质体包裹转染PEF和MEF。通过荧光显微镜和荧光定量PCR法(RT-QPCR)检测GFP表达水平和插入效率。结果表明，SB100x介导外源基因插入基因组拷贝数及GFP转录水平均显著高于SB11和SB16，提示SB100x具有较高转座活性，可用于SB转座系统特性研究。
　　4.为了比较SB、PB和Tol2转座子的转座效率，将pT3-PST-CAG-GFP分别和三种转座酶载体SB100x、PBase及Tol2TBase共转染PEF和MEF细胞，同时设置不同的质量比梯度:10∶1、5∶1、1∶1、1∶5和1∶10。通过荧光显微镜和RT-QPCR法检测GFP表达水平和插入效率。结果表明，SB介导外源基因插入基因组拷贝数及GFP转录水平均显著高于PB和Tol2，提示SB系统转座活性优于PB和Tol2。结果还表明三者获得最高转座率的转染质量比不同，其中SB、PB在PEF及MEF中最高转座率的转染质量比相同，SB系统为1∶1，PB系统为1∶10，Tol2系统在PEF及MEF中最高转座率的转染质量比不同，PEF中为1∶10，MEF中为1∶5。
　　上述实验结果表明:SB、PB和Tol2三种转座子介导的表达载体均能在PEF和MEF细胞高效转座和表达;SB转座活性高于PB和Tol2;SB系统存在转座酶过量抑制效应，而PB和Tol2则不存在明显的过量抑制效应。