大鼠T细胞受体Vβ5.2-HSP70和Vβ8.2-HSP70基因真核表达质粒的构建及表达

摘要

目的:构建含大鼠TCR Vβ5.2-HSP70和TCR Vβ8.2-HSP70基因的重组真核表达质粒,并检测其在体内外的表达。方法:实验于2005-10/2006-09在首都医科大学免疫学系实验室完成。①以自主构建的重组表达载体pTARGET-TCR Vβ5.2和pTARGET-TCR Vβ8.2为模板,将结核杆菌HSP70的一段保守序列P111-125设计到引物中,通过PCR的方法得到TCR Vβ5.2-HSP70和TCR Vβ8.2-HSP70基因片段,将其插入到真核表达载体pTARGET中,构建重组表达载体pTARGET-TCR Vβ5.2/8.2-HSP70。②将BALB/c小鼠48只随机分为4组,pTARGET-TCR Vβ 5.2-HSP70组、pTARGET-TCR Vβ8.2-HSP70组和空质粒组肌注相应的质粒DNA100μg/次,PBS组注射PBS缓冲液100μL/次。共注射3次,每次间隔2周。于末次免疫后3d取注射部位的肌肉,用RT-PCR及免疫组化染色法检测TCR Vβ5.2/8.2-HSP70基因在注射部位的转录和表达。③将COS-7细胞分为pTARGET-TCR Vβ5.2-HSP70组、pTARGET-TCR Vβ8.2-HSP70组、空质粒组和未转染细胞组,进行相应质粒转染,24h后收集细胞,用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达。结果:①TCR Vβ5.2/8.2-HSP70基因已被正确插入到pTARGET载体中。②pTARGET-TCR Vβ5.2-HSP70组、pTARGET-TCR Vβ8.2-HSP70组小鼠免疫处的肌肉组织RT-PCR检测显示,在500～600bp和400～500bp处出现特异的扩增带,分别与TCR Vβ5.2-HSP70和TCR Vβ8.2-HSP70基因片段的大小相符,而注射空质粒组和PBS组均未见此条带。③免疫组化结果显示转染重组质粒pTARGET-TCR Vβ5.2/8.2-HSP70的COS-7细胞的胞质及胞膜都有明显的着染。结论:成功构建了重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ5.2/8.2-HSP70,并在体内外检测到其转录和表达,为进一步进行TCR DNA疫苗治疗胶原诱导性关节炎的实验研究奠定了基础。