人脂肪来源干细胞增强型绿色荧光蛋白质粒转染及体内示踪

摘要

目的:对于人脂肪来源干细胞的应用,目前已开始进行临床前期体内移植实验,细胞标记与示踪是证明移植细胞转归和生成组织来源的关键问题.实验观察了带有增强型绿色荧光蛋白的基因质粒转染人脂肪来源干细胞的效果及体内示踪效应.方法:实验于2007-03/12在沈阳军区总医院整形美容外科中心实验室(省级)、沈阳军区呼吸中心实验室(国家级)和全军神经外科中心实验室(国家级)完成.①细胞来源与动物:脂肪组织取自1例腹壁整形术女性患者,对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.清洁级雄性裸鼠8只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.大肠杆菌JM109由本室保存.转染质粒pEGFP-N3为美国Clontech公司产品.②实验方法:无菌条件下切取患者脂肪组织,采用酶消化法体外分离培养脂肪来源干细胞,传至第3代时以2.5×107L-1密度接种,分别加入200,300,400,500,600,700,800,900mg/L G418,确定G418杀死所有细胞的最低浓度(C0).采用脂质体法对人脂肪来源干细胞进行pEGFP-N3质粒转染,C0浓度G418筛选,计数阳性细胞率.培养5代后制备单个细胞悬液,浓度为8×1010L-1,植入到裸鼠背部皮下,采用活体化学发光和荧光成像系统观察大鼠荧光表达情况.结果:①体外培养的人脂肪来源干细胞贴壁后为成纤维细胞样,细胞生长活性良好,传代后生长速度加快.②当G418浓度为600 mg/L时细胞全部死亡,故将此浓度设定为C0.③pEGFP-N3质粒-脂质体复合物转化脂肪来源干细胞24 h后,绿色荧光蛋白阳性细胞率为(13.0±3.5)%,经C0浓度G418筛选后高达(65.0±5.4)%.④裸鼠背部皮下注射脂肪来源干细胞8周后,可见移植区周围弥漫分布绿色荧光区,提示植入细胞存活并广泛分布.结论:增强型绿色荧光蛋白质粒可以有效转染人脂肪来源干细胞,并在裸鼠体内呈现良好的示踪效果.