铽掺杂纳米羟基磷灰石标记人脂肪来源干细胞及其体内示踪研究

摘要

干细胞治疗为一些传统治疗效果欠佳的疾病和损伤提供了新的治疗方法。为了能够使干细胞发挥最大的治疗效果，我们有必要明确干细胞移植入体内是如何存活、增殖、分化以及归巢的过程。细胞标记(labeling)和示踪(tracing)是观察干细胞体内外变化的有效手段。目前常用的示踪剂包括有机染料、超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide，SPIO)、量子点(quantum dots，QDs)等等，但是存在着荧光强度衰减、细胞毒性和不稳定性等缺点。掺杂镧系元素的纳米颗粒是一种新型生物示踪材料，与传统示踪材料相比，它改善了示踪灵敏性。本研究应用水热法合成铽掺杂纳米羟基磷灰石(Terbium doped hydroxyapatitenanoparticles，Tb-nHA)标记示踪人脂肪来源干细胞(human adipose-derived stemcells，hADSCs)，观察对其增殖分化影响，评价标记示踪效能，为干细胞体内外研究提供一种新的标记示踪手段。
　　目的:1.探索Tb-nHA制备方法。
　　2.观察Tb-nHA对hADSCs生物学影响。
　　3.Tb-nHA标记hADSCs的机制初探。
　　4.评价Tb-nHA标记示踪hADSCs的效能。
　　方法:1.应用磷酸钠、硬质胺、油酸、乙醇、Tb(NO3)3和硝酸钙为原料，应用水热法合成铽(Tb)掺杂纳米羟基磷灰石。
　　2.Tb-nHA表征检测:X射线衍射仪检测结晶程度和物象组成;透射电镜下观察其基本形态、大小和团集情况，荧光显微镜观察荧光性质。
　　3.利用胶原酶消化法分离、培养hADSCs，并进行成骨和成脂诱导分化，应用组织化学染色、流式细胞分析鉴定其干细胞特性。
　　4.不同浓度的Tb-nHA标记hADSCs，应用组织化学染色、real-time PCR观察其对细胞的增殖分化的影响。
　　5.应用共聚焦显微镜观察经Tb-nHA标记后不同代次的hADSCs的荧光强度变化，并应用透射电镜和共同区域化方法探讨标记机制。
　　6.将Tb-nHA标记的hADSCs与珊瑚羟基磷灰石(CHA)复合，植入裸鼠皮下，术后3M和6M取材，荧光显微镜下观察荧光变化。
　　结果:1.水热法合成的Tb-nHA形态均一，电镜下观察呈棒状，平均直径为13.05±1.34nm，平均长度为173.56±23.84nm。
　　2.Tb-nHA在265nm激发光激发下呈绿色荧光，发射波长为544nm，X射线衍射和傅立叶变换红外线光谱仪分析结果提示Tb-nHA为符合HA晶体结构。
　　3.人脂肪组织经胶原酶消化培养出的贴壁生长的梭形细胞具有间充质干细胞生物学特点。
　　4.应用含有50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml Tb-nHA的基础培养基对hADSCs进行培养，MTT检测提示不影响其细胞增殖，流式细胞分析提示不改变其间充质干细胞的表面标记，免疫组织化学染色提示不影响其成骨、成脂分化，real-timePCR检测成骨诱导培养后第7天、第14天和第21天相关基因表达不受影响。
　　5.共同区域化溶酶体膜相关蛋白1（LAMP-1）的免疫荧光染色提示发绿色荧光的Tb-nHA与发红色荧光的LAMP-1重合;透射电子显微镜观察到Tb-nHA标记的细胞内大量吞噬体，其中可见棒状纳米材料。共聚焦显微镜观察标记了Tb-nHA的hADSCs经过十余代次后，荧光虽然有所减弱，但荧光强度无统计学差异。
　　6.Tb-nHA标记hADSCs与珊瑚羟基磷灰石(CHA)复合材料在裸鼠体内3个月和6个月后，荧光显微镜下观察可见发绿色荧光的细胞，其荧光强度无明显衰减，免疫组织化学染色提示Tb-nHA所示踪的细胞为hADSCs。
　　结论:1.水热法合成的Tb-nHA具有纳米级形态特点，符合HA晶体结构，在265nm激发光激发下可以发出绿色荧光。
　　2.胶原酶消化法可以分离获得具有间充质干细胞特性的hADSCs，Tb-nHA不会影响hADSCs增殖分化能力。
　　3.Tb-nHA标记hADSCs是通过细胞的胞吞作用完成的，主要位于胞内的溶酶体内。
　　4.Tb-nHA标记hADSCs具有荧光强度衰减缓慢的特点，不论体外标记，还是体内示踪，其效能优于传统有机染料，可以用于干细胞的长期示踪。

目录

摘要

前言

第一部分 铽掺杂纳米羟基磷灰石的制备和表征

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 铽掺杂纳米羟基磷灰石对人脂肪来源干细胞的生物学影响

一、材料与方法

2 结果

3 讨论

第三部分 铽掺杂纳米羟基磷灰石示踪人脂肪来源干细胞的效能研究

1 材料与方法

2．结果

3．讨论

全文总结

文献综述 纳米技术与干细胞示踪

参考文献

附录

英文缩略词表

发表文章与交流

致谢

声明