应用Cyclin D1和bcl-2为靶标的siRNA慢病毒载体构建和鉴定

摘要

背景:近年来,与骨肉瘤耐药相关的基因研究大多局限于单个基因或单个通路。而进行细胞凋亡和细胞周期调控双通道同时阻断有可能逆转药物耐受机制。目的:构建bcl-2和cyclin D1特异性siRNA慢病毒载体,拟将其转入骨肉瘤耐药细胞株,探讨对骨肉瘤耐药性的逆转作用。方法:采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法,将bcl-2和cyclin D1基因分别插入慢病毒载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中,构建bcl-2和cyclinD1与pSIH1-H1-copGFP共表达的慢病毒载体(pSIH1-H1-copGFP-bcl-2-siRNA和pSIH1-H1-copGFP-cyclin D1-siRNA)。构建成功后的慢病毒质粒系统和pPACK包装质粒共转染293T细胞,过滤,浓缩病毒,利用荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果与结论:4对bcl-2和cyclin D1特异性siRNA与双酶切慢病毒载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector连接成功。共转染293T细胞包装病毒并浓缩后滴度达1.14×104ifu/μL,适合感染目的细胞。实时荧光定量PCR检测结果显示对bcl-2和cyclinD1基因的干扰效率最高分别达88%和87%。证实将siRNA技术应用于bcl-2和cyclin D1,能够构建出有效的bcl-2和cyclin D1特异性siRNA慢病毒载体。