不同分化胆管癌差异表达基因的分离、克隆和功能研究

摘要

@@ 从分子水平研究胆管癌发病机理及病理过程,对认识及防治胆管癌都具有重要的理论和实际意义.基于临床研究的结果[1],我们采用Liang 1992年建立的差异显示法(DDRT-PCR)[2],来寻找高、低分化胆管癌间差异表达基因的cDNA.rn1.材料和方法:(1)采用TRIzol总RNA提取试剂盒,分别提取高分化、低分化胆管癌新鲜组织总RNA,逆转录合成单链cDNA.(2)DDRT-PCR:在20 μL体系中对2 μL逆转录产物进行扩增,加入2 μmol/L 4dNTPs, 5 μmol/L 锚定引物T15M, 1 μmol/L随机引物, 37Bqα-32P-dCTP,1.5UTaq酶.(3)DD-PCR产物取6 μL上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒定功率50W,电泳约3 h,滤纸揭胶,覆保鲜膜后压X光片,-70 ℃曝光14 h,显影.确定感兴趣的差异片段的位置并切胶,将切下的凝胶常规方法提纯并进行再扩增.(4)反向Northernblot鉴定:点样后,用化学变性及热变性法交联,标记探针基本上按照文献[3]进行.常规方法68℃杂交12 h,中等强度洗膜后放射自显影,-80 ℃压片22 h,显影.(5)PCR产物经纯化后可以直接用来测序,测序引物用T15N,PCR产物的核苷酸序列分析采用全自动DNA序列分析仪及配套的ABI试剂.