MBF1基因的分离克隆与其在家蚕各组织不同时期的差异表达

摘要

转录因子及其调控机理已经逐渐成为基因分子生物学研究领域的重点,与转录因子活力有密切关联的是辅助活化因子,它能增强转录因子和顺式作用元件的结合,目前已经从真菌、多细胞动物和植物中分离出多种此类基因。Multiprotein Bridging Factor1(MBF1)是一个辅助活化活子,其序列从酵母到人都是相当保守的,MBF1通过一个激活物和一个TATA盒结合蛋白的桥连作用来调节转录激活。本论文拟通过构建MBF1基因的表达载体及其在家蚕各组织不同时期mRNA表达量的比较,研究MBF1基因的分子作用机制,了解其生物学功能。主要研究内容及结果如下:
　　 1.家蚕MBF1基因的克隆
　　 以家蚕后部丝腺的总RNA为模板,体外反转录合成cDNA,以cDNA为模板,通过PCR扩增得到得458 bp大小的片段,将其与pUCm-T载体连接,通过测序验证其正确性。
　　 2.转移载体pFastBacHTa-MBF1与重组病毒Bacmid-MBF1的构建
　　 验证的pUCm-T-MBF1质粒经Xhol和NotⅠ双酶切所得的目的片段与pFastBacHTa转移载体带有粘性互补末端,在T4 DNA Ligase的作用下进行连接,连接产物转经PCR鉴定与测序验证为重组中间载体质粒,且外源片段方向正确,命名为pFastBacHTa-MBF1。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统构建重组病毒Bacmid-MBF1,便于进一步研究其生物学功能。
　　 3.半定量与实时荧光定量技术分析家蚕各组织不同时期MBF1基因的表达
　　 根据已知家蚕的MBF1基因和actin基因序列,设计引物,通过逆转录方法获得家蚕cDNA,作为检测样品,将MBF1基因和actin基因分别克隆至pUCm-T载体上,测序验证其正确性。通过半定量和实时荧光定量PCR,的方法检测分别检测MBF1基因在家蚕各组织不同时期的表达。两种方法均检测出MBF1基因在家蚕各组织中都有表达,且丝腺中表达量最高。但两种检测方法灵敏度不同,实时荧光定量PCR技术实现了从定性到定量的飞跃,可以在PCR反应的过程中实时地检测其产物,并可在反应处于指数期时对PCR产物的量进行检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,数据更加可靠。通过对家蚕各组织不同时期MBF1 mRNA的表达量比较,为进一步研究其在家蚕体内的分布情况,检测其在家蚕组织中的表达丰度及在家蚕生长过程中的表达规律,了解其生物学活性及结构功能的关系尊定了基础。