二氨基肉豆蔻酸活化胱天蛋白酶依赖的线粒体途径诱导HL-60细胞凋亡

摘要

目的 探讨二氨基肉豆蔻酸(D-82)诱导HL-60细胞凋亡的作用及与线粒体途径活化的关系.方法 D-82 1.5,3和6 mg·L-1处理HL和细胞6 h,或D-82 6 mg·L-1处理细胞6,12及24 h后,锥虫蓝染色法检测细胞存活率;AO-EB染色分析凋亡率;琼脂糖凝胶电泳检测DNA损伤;罗丹明123染色流式细胞术检测线粒体膜电位变化;比色法测定胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9活性;Western印迹法检测胞浆和线粒体细胞色素c(Cyt c)及细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达.结果 D-82的浓度和作用时间与HL-60细胞存活率密切相关,相关系数分别为0.938(P<0.01)和0.809(P<0.05).D-82 1.5,3和6 mg·L-1处理HL-60细胞6 h,细胞存活率分别为(81±11)%,(70±9)%和(56±11)%;D-82 6 mg·L-1作用HL-60细胞12和24 h,存活率降至(36±7)%和(24±9)%.D-82 1.5,3和6 mg·L-1诱导HL-60细胞出现凋亡形态学改变及DNA阶梯状条带,凋亡率从正常对照组的(2±2)%上升至(18±4)%,(40±11)%和(75±11)%(n=3,P<0.05).D-82 3和6 mg·L-1组,罗丹明平均荧光强度由正常对照组的24±5降至20±5及12±4(n=3,P<0.05),说明线粒体膜电位降低;D-82 3和6 mg·L-1组胱天蛋白酶3活性分别增加39%和125%,胱天蛋白酶9活性分别增加61%和145%(P<0.05,P<0.01).与正常对照组比,D-82 3和6 mg·L-1组线粒体cyt c表达分别降低22%和38%(P<0.05,P<0.01),胞浆中Crt c表达分别升高22%和65%(P<0.05);Bax表达分别增加45%和116%(P<0.05,P<0.01),Bcl-2表达分别减少27%和40%(P<0.01).结论 D-82通过活化胱天蛋白酶依赖的线粒体途径诱导HL-60细胞凋亡.