缺氧反应元件启动子-反义血管内皮生长因子165 cDNA和单纯疱疹病毒1-胸苷激酶基因共表达治疗骨肉瘤的体外研究

摘要

目的 探讨缺氧条件下,转基因细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达变化以及单纯疱疹病毒1-胸苷激酶(HSV1-TK)/丙氧鸟苷(GCV)系统对转基因细胞的特异杀伤作用.方法 以缺氧诱导因子-1/缺氧反应元件(HIF-1/HRE)基因调节系统为载体,采用DNA重组技术构建由HRE启动子驱动的含人反义VEGF165cDNA全长和HSV1-TK基因的真核表达质粒,将其稳定转染人骨肉瘤细胞系MG63.应用PCR和RT-PCR方法检测TK基因的整合及转录;用MTY法和混合共培养实验分别检测转基因细胞在缺氧或不缺氧条件下对GCV的敏感性以及HSV1-TK/GCV系统的"旁观者效应";ELISA法检测细胞在缺氧条件下VEGF表达变化;流式细胞仪检测细胞周期改变及电镜观察细胞超微结构变化.结果 成功构建了由HRE启动子驱动的含反义VEGF165 cDNA全长和潮霉素磷酸转移酶-单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HyTK)基因的真核表达质粒pBI-HRE-AsVEGF165-HyTK;得到转基因细胞系MG63TV;检测到MG63TV细胞内TK基因的DNA和mRNA.缺氧条件下,转基因细胞存活率与GCV浓度呈现剂量依赖性,对GCV的敏感性提高了100倍;HSV1-TK/GCV系统旁观者效应明显增强;肿瘤细胞VEGF分泌下降50%.缺氧和GCV共同作用使转基因细胞DNA合成抑制,细胞周期阻滞于G0～G1期,细胞发生凋亡和坏死.结论 利用肿瘤缺氧,HRE启动子能够实现反义VEGF165对体外培养的肿瘤细胞VEGF表达的靶向性抑制作用,并能增强HSV1-TK/GCV系统对肿瘤细胞的特异性杀伤作用和旁观者效应.该双基因共表达载体系统为实践联合抗血管生成和自杀基因治疗骨肉瘤提供了实验依据.