稳定整合靶向性MSP58基因RNA干涉载体的胶质瘤细胞系建立

摘要

目的 探讨经载体介导的RNA干涉法建立抑制癌基因微小球蛋白(58-kDa microspherule protein,MSP58)表达的稳转细胞系的可行性.方法 根据MSP58 cDNA编码序列,设计并合成针对MSP58基因的特异性RNA干涉片断,并将其克隆入pSilencer3.1-H1neo干涉载体中,构建MSP58基因shRNA真核表达载体pSilencer-MSP58.重组载体pSilencer-MSP58和pSilencer3.1-H1neo阴性对照载体pSilencer3.1-H1neo Negtive经脂质体LipofectamineTM2000介导法转染胶质瘤细胞株U251;转染细胞经过G418筛选,采用逆转录酶-多聚酶链反应(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)、Western blot方法分别在mRNA水平和蛋白水平检测、筛选G418抗性的克隆细胞.结果 成功构建了MSP58基因shRNA真核表达载体pSilencer-MSP58,经酶切、测序鉴定证实克隆正确.获得了稳定转染pSilencer-MSP58载体的6个胶质瘤细胞株.结论 特异性shRNA能够明显抑制MSP58基因在U251细胞中的表达,并建立了稳定整合有靶向MSP58基因RNA干涉载体的胶质瘤细胞系,这为进一步研究MSP58在胶质瘤细胞系U251中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.