稳定整合靶向性14-3-3ζ基因RNA干涉载体的胶质瘤细胞系建立

摘要

目的 构建针对细胞凋亡抑制蛋白14-3-3ζ基因的特异性RNA干涉载体,并建立稳定转染该干涉载体的人胶质瘤细胞系.方法 根据14-3-3ζ编码序列,设计并合成针对14-3-3ζ基因的特异性RNA干涉片断,并将其克隆入pSilencer3.1-H1 neo干涉载体中,构建14-3-3ζ基因shRNA真核表达载体pSilencer-14-3-3ζ.重组载体pSilencer-14-3-3ζ和pSilencer3.1-H1neo阴性对照载体pSilencer3.1-H1 neo Negative经脂质体LipofectamineTM 2000介导法转染胶质瘤细胞株U251;转染细胞经过G418筛选,采用Western blot方法 分别在蛋白水平检测、筛选G418抗性的克隆细胞.结果 酶切鉴定和核苷酸序列分析证实,成功构建了14-3-3ζ基因shRNA真核表达载体pSilencer-14-3-3ζ,经酶切、测序鉴定证实克隆正确.获得了稳定转染pSileneer-14-3-3ζ载体的胶质瘤细胞株.结论 14-3-3ζ基因特异性RNA干涉载体能够显著抑制14-3-3ζ基因在U251细胞中的表达,这为进一步研究14-3-3ζ在胶质瘤细胞系U251中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.