新型硫化氢供体调控环磷酸鸟苷/蛋白激酶G信号通路对癫痫大鼠海马Kir6.2表达的影响

摘要

目的 探究硫化氢的抗癫痫机制即调控环磷酸鸟苷/蛋白激酶G(cGMP/PKG)信号通路对三磷酸腺苷敏感性钾通道(KATP)亚基Kir6.2表达的影响.方法 将60只SD大鼠按随机数字表法分为6个组(每组10只):(1)正常对照组;(2)癫痫组;(3)硫化氢供体干预组;(4)硫化氢供体加PKG抑制剂(KT5823)组;(5)硫化氢供体加KATP抑制剂(格列本脲)组;(6)硫化氢供体正常对照组.采用腹腔注射戊四氮致大鼠癫痫发作,记录潜伏期、首次发作级别、持续时间;记录癫痫发作时海马脑电图的变化;采用蛋白质印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应法检测海马组织中PKG、Kir6.2 mRNA和蛋白的表达水平,酶联免疫吸附测定法检测海马组织中cGMP、磷酸化PKG的浓度.结果 癫痫组出现Ⅳ～Ⅴ级发作,级别为4.500(4.000,4.875)级,潜伏期短[(10.37±8.21) min],持续时间长[(69.50±24.37)s].与癫痫组相比,硫化氢供体干预组的发作级别降低(P=0.004),潜伏期延长(P＜0.001)和持续时间缩短(P＜0.001).硫化氢供体加PKG抑制剂组与硫化氢供体干预组相比,潜伏期缩短(P＜0.001),持续时间延长(P＜0.001).硫化氢供体干预组癫痫波明显减少,波幅与癫痫组相比差异有统计学意义(P＜0.001);硫化氢供体加PKG抑制剂组与硫化氢供体干预组相比癫痫波增加,波幅增大(P＜0.001).组间比较结果提示,各组PKG mRNA和蛋白的表达水平存在差异(分别为n=5,H=26.714,P＜0.001和n=5,F=30.597,P＜0.001);其中与正常对照组相比,癫痫组PKG mRNA(分别为1.000±0.001和0.782±0.064,P=0.023)和蛋白(分别为0.550±0.037和0.145±0.020,P=0.042)的表达水平显著下降.组间比较结果提示,各组Kir6.2 mRNA和蛋白的表达水平存在差异(分别为n=5,H=27.761,P＜0.001和n=5,F=60.659,P＜0.001);其中与正常对照组相比,癫痫组Kir6.2 mRNA(分别为1.000+0.001和0.897±0.033,P=0.004)和蛋白(分别为0.384±0.035和0.215±0.016,P=0.024)的表达水平显著下降,cGMP(P＜0.001)、磷酸化PKG(P＜0.001)的浓度降低;与癫痫组相比,硫化氢供体干预组PKG mRNA (P=0.047)、Kir6.2 mRNA(P=0.011)、PKG蛋白(P＜0.001)和Kir6.2蛋白(P＜0.001)的表达水平则上升,cGMP、磷酸化PKG的浓度升高(均P＜0.001);尤其是与硫化氢干预组相比,硫化氢供体加PKG抑制剂组PKG mRNA (P=0.015)、Kir6.2 mRNA(P=0.013)、PKG蛋白(P=0.027)和Kir6.2蛋白(P=0.017)的表达水平下降,cGMP(P=0.005)、磷酸化PKG(P＜0.001)的浓度降低.结论 硫化氢可抑制大鼠癫痫发作,其机制之一可能与激活海马中cGMP/PKG信号通路上调KATP通道亚基Kir6.2的表达从而降低海马的兴奋性有关.