不对称重组酶介导扩增结合分子信标检测金黄色葡萄球菌方法的建立与应用

摘要

目的建立一种基于重组酶介导扩增技术（RAA）与分子信标相结合的病原菌恒温快速检测方法。方法方法学的建立。通过金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）所对应的基因设计相应引物及分子信标探针,不断调整引物浓度比例以确定最佳引物浓度比来进行不对称扩增,利用不对称重组酶介导扩增并与分子信标探针杂交,通过琼脂糖凝胶电泳及荧光采集观测结果。将阳性质粒以10倍的梯度稀释,检测该方法的灵敏度。利用该RAA杂交法检测大坪医院检验科微生物室保存的2016年12月的72株包含金黄色葡萄球菌及葡萄球菌属其他种细菌的菌株,以检测该方法的特异性。在特异性实验基础上添加我室保存的2016年12月的39例其他菌株进行Kappa一致性检验及临床诊断效能评价。结果当限制性引物与非限制性引物的浓度比例在1:20时,产生单链DNA（ssDNA）的效率最高。不对称RAA扩增与分子信标探针杂交的效率明显高于对称扩增。该方法的灵敏度为20拷贝/μl。RAA杂交法能够将金黄色葡萄球菌与葡萄球菌属其他菌株区分,与传统金标准相比Kappa为0.860,一致性良好。经过对111株菌株的检测,该方法敏感度为92.5%（37/40）,特异度为97.2%（69/71）,阳性预测值为94.9%（37/39）,阴性预测值为95.8%（69/72）,阳性似然比为33.04,阴性似然比为0.077,约登指数为0.897。与传统金标准相比,Kappa为0.902,两种方法一致性良好。结论通过对不对称RAA扩增条件的优化及与分子信标探针的结合,建立了RAA杂交技术检测细菌:DNA的新方法,为恒温扩增应用于临床奠定基础。