pGPU6／GFP质粒介导的表达钙网织蛋白基因的短发夹RNA的构建和鉴定

摘要

目的：构建靶向钙网织蛋白（ CRT）基因的短发夹RNA（ shRNA）表达质粒并鉴定。方法设计并合成4对针对CRT基因的shRNA链，退火形成双链，与酶切的质粒pGPU6/GFP连接，构建4个重质粒，转化DH5а菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。脂质体法转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞，通过荧光倒置显微镜判定转染效率，并通过Western印迹法检测细胞中CRT基因及蛋白的表达水平。结果经酶切鉴定筛出的重组质粒测序结果与目的序列相同，重组质粒pGPU6/GFP/Neo-CRT构建成功；转染 MDA-MB-231细胞后，CRT基因在 mRNA及蛋白水平的表达均降低，其中pGPU6/GFP/CRT1的抑制效果最好。结论成功构建了靶向CRT基因的shRNA表达质粒，并筛选出1种对CRT基因有显著抑制作用的shRNA。