大鼠蛋白精氨酸甲基转移酶1短发夹RNA质粒的构建、鉴定及体外RNA干扰

摘要

一、编码大鼠PRMT1基因shRNA质粒的构建和鉴定。 目的：为研究蛋白精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)基因表达的改变与血管内皮功能及动脉粥样硬化的关系,我们构建了PRMT1短发夹RNA质粒(pPRMT1-shRNA)。 方法：在GenBank中查到大鼠PRMT1基因mRNA序列并输入siRNA网上设计软件OptiRNA中,选取两条靶序列,设计并合成编码shRNA序列的DNA单链,经退火连接后,与双酶切线性化处理回收的pGenesil-1质粒载体连接,用含卡那霉素抗性的LB平板筛选阳性克隆,小提质粒后行酶切鉴定并测序。 结果：构建的大鼠pPRMT1-shRNA经酶切鉴定及测序与预期相符。 结论：本研究结果为进一步进行体外基因干扰PRMT1研究奠定了基础。 二、PRMT1-shRNA质粒转染大鼠主动脉内皮细胞条件的优化目的：优化pPRMT1-shRNA在聚乙烯亚胺转染剂jetPEITM-RGD介导下转染原代培养大鼠主动脉内皮细胞的转染条件。 方法：贴块法原代培养大鼠主动脉内皮细胞,经免疫细胞化学法(S-P法)鉴定,取3～4代细胞,按不同jetPEITM-RGD/pPRMT1-shRNA比例进行转染,24小时后测定各组转染效率及细胞存活率。 结果：6孔培养板每孔加入3.0μg的pPRA4T1-shRNA并以N/P=5加入jetPEITM-RGD转染效率最高,为53.54％。 结论：本研究为高效地进行细胞转染及进一步研究基因干扰PRMT1基因对血浆同型半胱氨酸(Hcy)、非对称性二甲基精氨酸(ADMA)水平和血管内皮功能的影响奠定了基础。 三、PRMT1-shRNA质粒对大鼠主动脉内皮细胞PRMT1表达的影响。 目的：探讨pPRMT1-shRNA在体外对大鼠主动脉内皮细胞PRMT1基因mRNA表达水平的影响。 方法：用pPRMT1-shRNA1、pPRMT1-shRNA2阳性质粒、阴性对照pHK质粒转染大鼠主动脉内皮细胞,同时设立空白对照组。转染12、24小时后分别收集各组细胞,提取细胞总RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、2％琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像分析系统分析各组PRMT1基因的mRNA表达情况。 结果:pPRMT1-shRNA1及pPRMT1-shRNA2转染组12、24小时PRMT1基因mRNA表达较阴性对照pHK及空白对照组均明显降低(P<0.01);pPRMT1-shRNA1及pPRMT1-shRNA2转染组24小时PRMT1基因mRNA表达受抑较12小时显著(P<0.05),且pPRMT1-shRNA1组比pPRMT1-shRNA2转染组受抑更显著(P<0.05);而阴性对照pHK及空白对照组12及24小时PRMT1基因mRNA表达无明显差异,同一时间阴性对照pHK与空白对照组之间无明显差异。 结论：本研究所构建的pPRMT1-shRNA1及pPRMT1-shRNA2可在体外高效特异地抑制PRMT1的表达,为进一步的体内实验奠定了基础。

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文摘

英文文摘

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前 言

第一部分编码大鼠PRMT1基因shRNA质粒的构建和鉴定

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第二部分PRMT1-shRNA质粒转染大鼠主动脉内皮细胞条件的优化

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第三部分PRMT1-shRNA质粒对大鼠主动脉内皮细胞PRMT1表达的影响

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

结论

参考文献

综 述 非对称性二甲基精氨酸、同型半胱氨酸与心血管疾病的关系研究进展

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