Wnt3a促进人晶状体上皮细胞增生及相关机制的研究

摘要

背景晶状体上皮细胞（LECs）的异常增生是晶状体后囊膜混浊（PCO）的重要病理基础，以往研究证实Wnt3a信号可促进上皮细胞的增生，但其对LECs的作用机制尚不清楚。目的研究Wnt3a对人LECs增生的作用，探讨相关分子机制，为PCO的临床治疗提供新的靶点。方法将人LECs系SRA01／04细胞进行培养后以4×105个／孔的密度接种于6孔板继续孵育。构建Wnt3a cDNA表达载体，采用脂质体介导转染技术将Wnt3a cDNA表达载体瞬时转染入SRA01／04细胞中，对照组转染pcDNA3-HA表达载体。采用Western blot技术验证载体在转染细胞中的表达；MTT法和流式细胞仪检测Wnt3a在SRA01／04细胞中的过表达对细胞增生能力的影响；Western blot法检测Wnt3a过表达对Wnt／β-catenin下游信号分子β—catenin、cyclin D1和c—myc蛋白表达的影响；应用免疫荧光法检测Wnt3a过表达后β—catenin表达的定位变化；采用免疫细胞化学法检测Wnt3a过表达后增生细胞核抗原（PCNA）蛋白表达的变化。结果本研究成功构建了人Wnt3a基因的表达载体Wnt3acDNA，获得Wnt3a过表达的wnt3a／SRA01／04细胞及对照peDNA3-HA／SRA01／04细胞。Western blot检测证实，与pcDNA3-HA／SRA01／04相比，Wnt3a／SRA01／04细胞内Wnt3a蛋白表达明显升高。MTT法检测表明，Wnt3a cDNA转染组SRA01／04细胞的增生率明显高于对照组（F分组=15．235，P=0．005；F时间=369．677，P=0．000），转染后各时间点2个组间SRA01／04细胞的增生率差异均有统计学意义（t=20．843，P=0．001；t=26．214，P〈0．01；t=25．177，P=0．001；t=35．516，P〈0．01；t=615．056，P〈0．01）。细胞周期分析发现，Wnt3a cDNA转染组G．期细胞比例为51．74％，明显少于对照组的79．44％，而s期细胞的比例为36．23％，明显多于对照组的12．34％。Wnt3a cDNA转染组SRA01／04细胞PCNA蛋白表达阳性率为47．00％±7．58％，明显高于对照组的16．00％±3．61％，差异有统计学意义（t=8．256，P〈0．01）。转染后48h，β—catenin蛋白密集分布于Wnt3a／SRA01／04细胞核和细胞质中，而在对照组仅出现于细胞质之中。Wnt3a／SRA01／04细胞中Wnt3a蛋白表达水平上调，β—catenin细胞定位由细胞质转入细胞核；Wnt／β-catenin信号通路靶蛋白Cyclin D1和c—Myc蛋白表达上调。结论在SRA01／04细胞中，Wnt3a过表达使Wnt／β-catenin信号通路活化，下游靶蛋白Cyclin D1和c—Myc表达上调，可促进人LECs的增生。