非致死性过氧化氢持续性损伤对视网膜色素上皮细胞连接的影响

摘要

背景活性氧中间产物可导致细胞氧化损伤，视网膜色素上皮（RPE）细胞对视细胞外节膜盘的吞噬产生了大量的活性氧中间产物过氧化氢（H2O2），易对RPE细胞本身造成反复的氧化损伤。目的探讨非致死性H2O2持续性损伤对RPE细胞连接的影响。方法ARPE-19细胞株以8×104个／L的密度接种在96孔板中，在24孔板中细胞爬片的接种密度为4×104个／L，并在DMEM／F12培养液中培养，无血清培养液饥饿培养24h后用于实验。将不同浓度（0～0．60mmol／L）的H2O2加入培养液，单溶液细胞增生（MTS）法检测不同浓度H2O2持续性损伤对RPE细胞活力的影响；用Transwell小室法培养细胞，跨上皮细胞电阻（TER）法检测细胞单层的形成时间；以罗丹明-异硫氰酸荧光素标记葡聚糖的量测定H2O2对RPE细胞单层通透性的影响；免疫荧光法检测RPE细胞之间紧密连接蛋白ZO-1的表达情况。结果不同质量浓度H2O2作用组细胞活力（A490值）的差异有统计学意义（F=991．501，P=0．000），0．20—0．60mmol／LH2O2组细胞活力明显低于对照组，差异均有统计学意义（t=3．200、11．368、4．256、2．929、10．818、15．433、64．125、98．805，P〈0．05）。ARPE-19细胞接种于Transwell小室后11d时TER值为（24．9±1．3）Q·cm2，7d时为（17．8±1．4）n·cm2，差异有统计学意义（t=5．228，P=0．014）；至第15天左右达到稳定水平，约为（25．9±0．9）Q·cm2。细胞通透性检测表明，无细胞的空白组葡聚糖渗漏量（相对荧光强度）为433．08±51．53，无H2O2的对照组渗漏量为255．39±16．44，明显低于空白组，差异有统计学意义（t=12．515，P=0．006）；H2O2处理的实验组渗漏量为363．28±26．17，较对照组渗漏增加，差异亦有统计学意义（t=14．412，P=0．005）。免疫荧光检测可见无H2O2，对照组细胞ZO-1连接完整，H2O2组较无H2O2对照组细胞ZO-1连接呈断裂状。结论非致死性H2O2持续性损伤对RPE细胞连接有破坏作用。