视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞对视网膜色素上皮层影响的实验研究

摘要

目的：观察视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞对小鼠视网膜色素上皮层的影响。
　　方法：1.体外分离、培养及冻存小鼠视网膜色素上皮细胞:取C57BL/6小鼠10只，脊髓脱臼法处死小鼠，取出眼球，清洗、去除眼前段组织后将眼杯泡在清洗液，用镊子轻轻挑起膨胀的视网膜神经上皮层，用显微剪在视盘表面去除视网膜神经上皮层，清洗后使用胰蛋白酶溶液消化，消化完成后用微量注射器轻轻吹打眼杯内表面，收集含黑色素颗粒的培养液，常规离心后接种于培养瓶中，放入培养箱中培养。完成取材后每天显微镜下观察细胞生长情况，2～3天更换一次培养液，细胞贴壁后隔天换液，当细胞融合度达约90％时，记录所用时间，并按1∶4的比例传代。传代后依旧每天显微镜下观察细胞生长情况，2～3天更换一次培养液。取第1、4代小鼠RPE细胞，消化后细胞计数，接种于24孔板，置于培养箱中培养，每日取3孔细胞进行计数，取平均值绘制生长曲线。将第1代的小鼠RPE细胞接种于24孔培养板中，3d后取出洗涤，冰丙醇固定，自然干燥后密闭保存，细胞爬片经漂洗后用过氧化物酶以消除内源性过氧化物酶活性，再次洗涤，然后加入鼠抗人RPE65蛋白一抗，孵育、漂洗后加入大鼠抗山羊以及山羊抗兔二抗，孵育、漂洗，二氨基联苯胺显色，置于显微镜下观察，若胞浆呈现棕黄色则为阳性，否则为阴性。空白对照组用PBS液代替一抗作阴性对照。第4代小鼠RPE细胞生长至细胞融合度达约90％时，即可行细胞冻存，配制20％胎牛血清加8％二甲基亚砜的冻存液，将细胞用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，同时计数，常规离心、重悬沉淀后移入冻存管，放入泡沫盒内，直接放入-80℃冰箱冻存以备后续实验行细胞复苏后使用。
　　2.小鼠视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞:从-80℃冰箱中取出冰冻的小鼠RPE细胞冻存管，解冻后将细胞转移至含RPE细胞培养液的离心管中混匀，常规离心、吸弃上清液后重悬细胞沉淀，转移悬浮液至培养瓶中，补加小鼠RPE细胞培养液至6 ml。复苏后小鼠视网膜色素上皮细胞状态不稳定，需传代2次后再行视网膜下腔移植，当细胞融合度约达90％时传代，洗涤、消化后显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，停止消化。离心、重悬沉淀后按照1∶8的比例传代至新的培养瓶中，轻轻摇匀后移入培养箱中。小鼠RPE细胞传代2次后显微镜下观察，当细胞融合度达90％以上时，用胰蛋白酶消化，离心重悬细胞沉淀后加入培养液混匀，制备成约1×106个/ml浓度的小鼠RPE细胞悬浮移植液。将30只7日龄C57BL/6J新生小鼠分成正常组、氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy，OIR)模型组及OIR模型细胞移植组，每组10只。OIR模型组及OIR模型细胞移植组建立OIR模型:将小鼠与母鼠共同置于氧浓度（75±2）％的氧箱内，箱内温度（23±2）℃，每天日光照射12h，饲养5d后转移至正常环境中饲养5d。正常组小鼠与母鼠共同置于密闭箱内，温度(23±2)℃，每天日光照射12h，饲养5d。对OIR模型细胞移植组小鼠行外路视网膜下腔移植手术。腹腔麻醉小鼠，切开眼球上方结膜少许，暴露巩膜，用显微铲针刺穿前房放出少许房水，在角膜缘后2mm处用显微注射器向着眼球后方稍平行巩膜斜向刺入球壁，注入细胞液，同样术式处理OIR模型组小鼠，注射小鼠RPE细胞培养液，术毕涂红霉素眼膏以防止感染。采用荧光显微镜观察各组小鼠RPE层的变化。取各组小鼠行视网膜冰冻切片，固定、脱水、包埋，切片后置于湿盒内，加入1∶50稀释的荧光标记RPE65，冲洗后，加入辣根过氧化物酶二抗，孵育、冲洗、染核、漂洗后转移至载玻片上，避光自然晾干，盖上盖玻片荧光显微镜下观察并拍照。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠RPE细胞RPE65、Bestrophin、ZO-1蛋白相对表达量。采用RT-PCR检测各组小鼠RPE细胞RPE65、Bestrophin、ZO-1 mRNA相对表达量。
　　结果：1.初分离的原代小鼠RPE细胞镜下可见胞体呈圆形，梭形，不规则形，内含丰富的黑色素颗粒，未见细胞核，12h后大部分细胞贴壁，贴壁细胞可见清晰的细胞核，4d后细胞融合成单层生长。传代后第1代细胞活力较强，2～3d后细胞融合，形态多呈梭形及不规则形，黑色素颗粒较多，但对比原代细胞明显变淡，第4代细胞，黑色素颗粒较少，细胞渐趋透明。生长曲线结果表明第1、4代小鼠视网膜色素上皮细胞均在第3d进入细胞对数生长期，4～5d生长显著，随后进入稳定期，其中第1代小鼠视网膜色素上皮细胞生长速度稍快于第4代。第1代小鼠视网膜色素上皮细胞经免疫细胞化学检测RPE65蛋白显示小鼠视网膜色素上皮细胞呈阳性反应，细胞胞浆内呈棕黄色，空白对照组呈阴性。
　　2.荧光显微镜观察发现，正常组小鼠RPE层呈结构整齐的单层排列，OIR模型组小鼠RPE层连续性中断，排列紊乱，部分位置缺失RPE细胞，OIR模型细胞移植组小鼠RPE层明显增厚，呈多层排列，结构整齐，细胞存活良好。Westernblot检测结果显示，正常组、OIR模型组、OIR模型细胞移植组RPE65蛋白相对表达量分别为123.750±6.752、100.000±15.492、124.000±5.292; Bestrophin蛋白相对表达量分别为95.250±15.414、52.750±15.392、109.000±20.833; ZO-1蛋白相对表达量分别为93.750±6.946、93.500±6.807、83.500±8.583。统计学分析结果示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐性检验p＞0.05，F=7.272、2.438、11.358，多组间差异RPE65蛋白、Bestrophin蛋白有统计学意义，p＜0.05，而Zo-1蛋白无统计学差异。组间多重比较采用LSD-t检验，其中RPE65蛋白相对表达量，正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p＜0.05，OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p＜0.05，而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义，p＞0.05。Bestrophin蛋白相对表达量，正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p＜0.05，OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p＜0.05，而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义，p＞0.05。ZO-1蛋白相对表达量，正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p＜0.05，OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p＜0.05，而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义，p＞0.05。RT-PCR检测结果显示，正常组、OIR模型组、OIR模型细胞移植组RPE65 mRNA相对表达量分别为0.895±0.118、0.393±0.123、0.928±0.169; Bestrophin mRNA相对表达量分别为0.818±0.161、0.317±0.120、0.735±0.278; ZO-1mRNA相对表达量分别为0.841±0.151、0.391±0.103、0.883±0.176。使用spss19.0统计学软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐性检验均p＞0.05，F=28.155、20.769、11.066，多组间差异有统计学意义，p＜0.05，组间多重比较采用LSD-t检验，其中RPE65蛋白相对表达量，正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p＜0.05，OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p＜0.05，而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义，p＞0.05。Bestrophin蛋白相对表达量，正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p＜0.05，OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p＜0.05，而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义，p＞0.05。ZO-1蛋白相对表达量，各组间均无统计学差异，p＞0.05。结果显示RPE65、Bestrophin蛋白相对表达量正常组、OIR模型细胞移植组均比OIR模型组增高，而OIR模型组细胞移植组与正常组无统计学差别;ZO-1蛋白相对表达量各组间均无统计学差异。
　　结论：1.改良酶消化法可以成功体外分离、培养及冻存小鼠RPE细胞，细胞纯度高、贴壁率高、细胞活力较强，为后续实验提供了细胞来源。
　　2.视网膜下腔移植RPE细胞可促进小鼠视网膜色素上皮层增殖，RPE层明显增厚，呈多层排列，结构整齐，细胞存活良好。通过对RPE65、Zo-1、Bestrophin三种蛋白和基因的检测发现，视网膜下腔移植RPE细胞可以增强调控维生素A的反式-顺式异构化能力及细胞吞噬能力，移植细胞的生物学功能得以发挥，而移植细胞与原宿主细胞的紧密连接的形成尚不充分。

目录

摘要

第一部分 小鼠视网膜色素上皮细胞的分离与培养

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

小结

第二部分 视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞对小鼠视网膜色素上皮层的影响

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

小结

全文总结

参考文献

综述 细胞移植在视网膜疾病中的应用进展

攻读学位期间发表论文

致谢

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