改良内皮抑素基因对大鼠角膜新生血管中血管内皮生长因子及其受体表达的抑制作用

摘要

背景内皮抑素（ES）是目前已知最强的内源性血管形成抑制因子，能抑制新生血管的发生，而精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列的聚合能增强Es基因的功能。目的探讨改良Es基因对大鼠角膜新生血管（CNV）中血管内皮生长因子（VEGF）及VEGF受体2（Flk-1）表达的影响及作用机制。方法102只清洁级sD大鼠按随机数字表法分为模型组、pCI空载体组、pCI—ES转染组、pCI—RGDRGD—ES转染组，每组24只；正常组6只。用浸有1mol／LNaOH溶液的直径3mm圆形滤纸片快速贴于大鼠角膜中央40s建立角膜碱烧伤CNV模型，以pCI质粒作为改良前后E5基因的表达载体，每周2次结膜下注射3μg含质粒的转染液进行基因治疗。每日裂隙灯显微镜下观察角膜水肿及CNV生长情况，计算CNV面积。于碱烧伤后1、4、7、14d用过量麻醉法处死模型鼠并获取角膜组织，用免疫组织化学法检测CNV内皮细胞中CD34的表达以计算CNV密度，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及Westernblot法分别检测角膜VEGFmRNA及Flk-1在角膜中的表达。结果角膜碱烧伤后7～14d，pCI—ES转染组、pCI—RGDRGD—ES转染组CNV面积均明显小于pCI空载体组和模型组，CNV密度均明显小于pCI空载体组和模型组，差异均有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01）；pCI—RGDRGD—ES转染组CNV面积均明显小于pCI—ES转染组，CNV密度均明显少于pCI—ES转染组，差异均有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01）。碱烧伤后4d，pCI—ES转染组、pCI—RGDRGD—ES转染组大鼠角膜Flk-1蛋白表达水平明显低于正常对照组大鼠，差异有统计学意义（P〈O．05）；碱烧伤后4d，pCI—ES转染组、pCI—RGDRGD—Es转染组大鼠角膜VEGFmRNA的表达水平明显低于正常对照组大鼠，差异有统计学意义（P〈O．05）；pCI—RGDRGD—ES转染组大鼠角膜VEGFmRNA表达水平明显低于pCI—ES转染组大鼠，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论结膜下注射Es基因或RGDRGD—ES基因均能抑制碱烧伤诱导的CNV，但RGDRGD—ES基因对CNV的抑制作用更强，其作用机制为抑制VEGF及其受体Flk-1的表达。