低氧对小鼠RGC-5细胞中膜联蛋白A2表达的抑制作用

摘要

背景研究已证实，缺氧是诱导视网膜新生血管形成的主要因素，与多种眼科病变的发生有关，且低氧与视网膜神经节细胞（RGCs）的变性也密切关联，但对视网膜神经组织病变的研究较少。目的观察低氧对RGCs中ANXA2表达的影响，探讨低氧对RGCs的损伤机制。方法用含体积分数10％胎牛血清的高糖培养液对小鼠RGC-5细胞株进行培养，采用免疫荧光技术检测RGCs特异表面抗原Thy-1的表达。分别采用含CoCl2终质量浓度为50、100、200、300μmol／L的培养液培养RGC-5细胞，并分别于培养后12、24、48h采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞吸光度（A）值，以不含CoCl2培养液培养RGC-5细胞作为正常对照。以含终浓度为100μmol／LCoCl2培养液培养RGC-5细胞以建立低氧细胞模型，将模型细胞分为低氧3h组、低氧6h组、低氧12h组、低氧24h组，正常培养的细胞作为正常对照组。各组细胞行Hoeehst 33342荧光染色，观察RGC-5细胞核形态的变化；采用实时定量逆转录PCR检测各组细胞中ANXA2 mRNA的相对表达量；采用Western blot法检测细胞中ANXA2蛋白的相对表达量；采用免疫荧光法观察ANXA2在细胞中表达的分布。结果体外培养的RGC-5细胞呈梭形或多边形，Thy-1反应阳性。与正常对照组比较，50和100μmol／LCoCl2组各时间点细胞A值的差异均无统计学意义（均P〉0．05）；200和300μmol／L CoCl2组各时间点细胞A值均明显低于正常对照组，差异有统计学意义（均P〈0．05）。正常对照组细胞核Hoeehst 33342染色未见致密的亮蓝色荧光，低氧3h组、低氧6h组、低氧12组和低氧24组细胞核内均可见致密的亮蓝色强荧光。低氧3h组、低氧6h组、低氧12h组和低氧24h组RGC-5细胞中ANXA2 mRNA的相对表达量分别为0．80±0．14、0．67±0．33、0．49±0．17、0．39±0．02，均明显低于正常对照组，总体比较差异有统计学意义（F=434．354，P=0．000）。低氧3h、6h、12h、24h组RGC-5细胞中ANXA2蛋白的相对表达量分别为0．5526±0．0123、0．4259±0．0334、0．3449±0．0178和0．3827±O．0221，明显低于正常对照组的0．6021±0．0014，总体比较差异有统计学意义（F=3．057，P=0．000）。免疫荧光结果显示ANXA2蛋白主要在RGC-5细胞核中表达，少量表达于细胞膜及细胞质中，各低氧组细胞质中ANXA2蛋白荧光弱于正常对照组。结论低氧条件下小鼠RGC。5细胞中ANXA2表达水平明显下调，可能与高糖环境下RGCs凋亡有关。