双重荧光定量RT-PCR法检测柯萨奇病毒A2和A5型

摘要

目的 建立同时检测柯萨奇病毒A2和A5型(CVA2、CVA5)的双重实时荧光定量RT-PCR法.方法 用Primer Express 3.0软件设计高度特异性引物和荧光标记探针.通过优化反应体系,建立标准曲线,并评价双重荧光定量RT-PCR法的特异性、灵敏度和重复性.用建立的方法检测367例疑似手足口病患儿的粪便标本,并对阳性结果测序验证.结果 荧光定量RT-PCR结果表明本实验所选的引物和探针可特异性检测并区分出CVA2、CVA5亚型,与其他肠道病毒的阳性核酸未发生交叉反应.该方法最低检测限达到102 copies/mL,批内变异系数(CV)均＜1.49％.367份临床标本中CVA2型阳性23份,阳性率6.3％;CVA5阳性11份,阳性率3％,检测阳性结果与测序结果一致.结论 成功建立了在单管中同时检测并鉴别CVA2、CVA5型的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法.该方法具有较好的灵敏度、特异性、重复性,可用于CVA2、CVA5型引起的暴发疫情的快速筛查和手足口病的流行病学的研究.