基于小干扰RNA构建的长发夹RNA表达载体对HBV基因复制和表达的抑制作用

摘要

目的研究靶向HBV X（HBx）基因的长发夹RNA （lhRNA）表达载体对HBV基因复制和表达的影响。方法以HBx为靶点, 合成四条小干扰RNA（siRNA）寡核苷酸并构建lhRNA表达载体。siRNA寡核苷酸序列（4个转染组）或长发夹RNA（lhRNA）表达载体（2个转染组）转染HepG2.2.15细胞后, 通过时间分辨免疫荧光法、荧光定量PCR及反转录PCR分别检测细胞培养上清液中的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、HBV DNA及细胞内的HBx mRNA水平。以转染阴性序列或空载体为阴性对照组。采用独立样本t检验评估siRNA对HBV基因复制和表达的抑制效果。结果与阴性对照组相比, siRNA-1及siRNA-4组以较高浓度（60 nmol/L或90 nmol/L）转染入HepG2.2.15细胞后, 培养上清液中的HBsAg、HBV DNA及HBx mRNA水平均显著降低（P＆0.05）, 其中, siRNA-1组在转染后不同时间点（24, 48, 72 h）细胞培养上清液中的HBsAg和HBV DNA载量均较对照组显著降低（P＆0.05或P＆0.01）。构建成功两个lhRNA表达载体:pMD-HBxlh1和pMD-HBxlh4, 其转染入细胞后, 培养上清液中的HBsAg及HBV DNA水平显著低于阴性对照组（P＆0.05）。结论新证实一个HBx基因的有效干扰靶点即siRNA-1。靶向HBx的lhRNA表达载体pMD-HBxlh1和pMD-HBxlh4可有效抑制HBV基因的复制和表达。