褪黑素对脑缺血-再灌注损伤大鼠大脑皮质细胞毒性水肿的影响研究

摘要

目的 探讨褪黑素对大鼠脑缺血-再灌注损伤(CIRI)后大脑皮质细胞毒性水肿的影响及其机制。方法 将60只成年健康无特定病原体雄性Sprague Dawley大鼠完全随机分为假手术组(Sham组,12只)、CIRI组24只、褪黑素治疗组(24只)。采用改良的Zea-Longa线栓法建立大鼠CIRI模型,其中褪黑素治疗组在建模前、后30 min腹腔注射褪黑素(5 mg/kg);CIRI组在建模前、后30 min经腹腔注射等量的等渗盐水。Sham组分离右侧颈总动脉后缝合皮肤,并于假手术前、后30 min注射等量的等渗盐水。建模后2、6、12、24 h及72 h, 3组大鼠(每组6只)均行活体MRI T2加权成像(T2WI)、扩散加权成像(DWI)检查,结合表观扩散系数(ADC)图,动态分析褪黑素干预后CIRI大鼠脑梗死体积百分比、脑水肿百分比及大脑皮质相对ADC(rADC)值的变化。建模后6、24 h及72 h,采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的2′-脱氧尿苷5′-三磷酸盐介导的缺口末端标记(TUNEL)法观察褪黑素对CIRI大鼠缺血侧大脑皮质细胞凋亡的影响;免疫荧光双标法观察褪黑素干预对星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)和钠-钾-氯协同转运蛋白1(NKCC1)的影响;免疫荧光染色结合蛋白质印记,探讨褪黑素对离子钙接头蛋白抗原(Iba-1)标记的小胶质细胞活化的影响。建模后24 h,苏木素-伊红(HE)染色观察褪黑素对CIRI大鼠缺血侧大脑皮质细胞形态学的影响,酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定褪黑素对炎性因子白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。采用Pearson相关性分析结合一般线性回归分析对建模后各时点CIRI组与褪黑素治疗组大鼠缺血侧大脑皮质Iba-1+细胞数差值与胶质纤维酸性蛋白(GFAP+)/AQP4+及GFAP+/NKCC1+细胞数差值进行相关性分析。结果 T2WI和DWI扫描结果显示,Sham组大鼠脑组织信号均匀,未见异常信号。建模后24 h, CIRI组见大范围异常信号脑损伤区,缺血侧大脑半球水肿,大脑中线向对侧移位;褪黑素治疗组脑损伤区范围较CIRI组减小,大脑中线向对侧移位减轻。建模后2、6、12、24 h及72 h,与CIRI组比较,褪黑素治疗组大鼠各时点脑梗死体积百分比、脑水肿百分比显著减少,大脑皮质rADC值显著增高(均P<0.05)。HE染色结果显示,Sham组大脑皮质细胞形态规则、排列整齐;建模后24 h, CIRI组缺血侧大脑皮质细胞形态不规则、排列紊乱,而褪黑素治疗组大脑皮质细胞形态较规则、排列较整齐。TUNEL检测及免疫荧光染色结果显示,Sham组大脑皮质见少量TUNEL+、GFAP+/AQP4+和GFAP+/NKCC1+、Iba-1+细胞表达,小胶质细胞胞体大小适中,呈高度分枝状;建模后24 h, CIRI组缺血侧大脑皮质TUNEL+、GFAP+/AQP4+、GFAP+/NKCC1+、Iba-1+细胞数较Sham组增多,小胶质细胞突起消失,形态呈现阿米巴样,褪黑素治疗组缺血侧大脑皮质TUNEL+、GFAP+/AQP4+、GFAP+/NKCC1+、Iba-1+细胞数较CIRI组减少,小胶质细胞胞体变小,突起较长。建模后6、24 h及72 h,与CIRI组比较,褪黑素治疗组大鼠各时点缺血侧大脑皮质TUNEL+、GFAP+/AQP4+、GFAP+/NKCC1+、Iba-1+细胞数均显著减少(均P<0.05)。蛋白质印迹及ELISA方法分析结果显示,建模后24 h,褪黑素治疗组Iba-1蛋白表达、IL-1β及TNF-α水平较CIRI组显著降低(均P<0.01)。建模后6、24、72 h,褪黑素治疗组与CIRI组缺血侧大脑皮质GFAP+/AQP4+及GFAP+/NKCC1+细胞数差值与Iba-1+细胞数差值呈极强正相关(r值分别为0.937、0.963),差异均具有统计学意义(均P<0.01)。结论 褪黑素可下调CIRI大鼠缺血侧大脑皮质星形胶质细胞AQP4及NKCC1蛋白的表达,改善细胞毒性水肿,减轻CIRI,其机制可能与抑制小胶质细胞活化有关。