短发夹RNA沉默hTERT基因对人喉癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用

摘要

背景与目的:RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指双链RNA导入细胞后诱导靶mRNA发生特异性的降解,导致基因转录后沉默的现象.RNAi在基因功能和抗病毒基因治疗等方面均有报道.但对喉癌等头颈恶性肿瘤中高表达的人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因,目前尚未见报道.本课题利用RNAi技术,研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)抑制hTERT基因表达对裸鼠喉鳞状细胞癌皮下移植模型的抑瘤作用.方法:根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA.建立人喉癌Hep-2细胞株裸鼠皮下接种模型.将pshRNA转染入荷瘤裸鼠瘤体内,观察肿瘤生长情况.以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤组织内的表达;以HE染色法观察质粒治疗后瘤组织的病理改变;以原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况;以免疫组化SP法检测hTERT蛋白在肿瘤内的表达;光镜下观察心、肝、肾、脾结构的改变并测量血液学和血液生化指标.结果:pshRNA组(A组)、空质粒载体组(B组)与生理盐水组(C组)之间比较,A组与C组瘤体积有显著性差异(P＜0.01),B组与C组之间瘤体积无显著性差异(P＞0.05),抑瘤率为76.50%.pshRNA及空质粒载体转染入瘤体后,共聚焦显微镜下见大量的癌细胞表达绿色荧光.病理学检查及TUNEL检测发现:A组肿瘤生长受到抑制,细胞分裂相少见,可见大量肿瘤细胞坏死及凋亡,该组肿瘤细胞的凋亡指数[(26.47±4.25)%]明显高于B组[(3.40±1.41)%]和C组[(2.73±1.35)%].给予pshRNA后瘤体内hTERT蛋白表达明显下调,而且对心、肝、肾、脾无明显损害,对造血系统无影响.结论:表达shRNA的DNA载体质粒沉默hTERT基因可显著抑制人喉癌裸鼠肿瘤的生长,而且对心、肝、肾、脾及造血系统无明显的毒副作用.