一种新型慢病毒载体制备方法的建立

摘要

为了建立新型、高产量的慢病毒载体制备体系,将构建好的主框架质粒pVECRNA、包装质粒pGAGPOL及包膜质粒pVSVG通过脂质体共转染至BHK21细胞,再用含有T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞,培养4d后,收集培养上清,提取培养上清的RNA,进行RT-PCR反应;将培养上清进行免疫印迹鉴定;将培养上清感染正常的293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞,荧光显微镜下观察细胞GFP的表达情况;采取3*3*3析因分析方法,优化系统产量,Real-time PCR方法测定细胞培养上清中病毒载体的拷贝数,利用流式细胞术检测病毒载体滴度.RT-PCR及p24免疫印迹结果均提示在细胞上清中存在慢病毒载体;通过荧光显微镜观察到感染组293T细胞、HepG2细胞、Vero细胞均表达绿色荧光蛋GFP,说明此系统制备出的慢病毒载体具有感染性;系统经优化后,培养上清中慢病毒载体拷贝数达到(11.71±0.80)×1011 copies/mL,培养上清原始滴度达到(1.3±0.18)×108tu/mL,高出目前常用制备体系产量1个数量级.初步建立了新型慢病毒载体制备体系,为今后该系统的大规模应用提供客观的科学依据.