CHO/dhfr-细胞定点整合高效表达系统的建立

摘要

为了克服随机整合建立高表达细胞株时"位置效应"所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统.首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan.该载体含有报告基因(k2 tPA)、扩增基因(dhfr)、重组酶识别序列(FRT)及筛选基因(neo),且neo基因的表达经过系统的弱化,确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选.然后利用该载体转染CHO/dhfr-细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆,并时阳性克隆进行系统分析,筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆,此克隆被认为筛选载体整合入CHO细胞基因组中转录热点(Hot spot)区域,从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系.随后利用位点特异性重组系统(FLP-FRT)将外源基因定点整合到Hot spot区域,以实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合及高效表达.并利用该细胞系实现了k2 tPA的高表达,表达量达到17.1μg/106 cell·24h.该研究致力于CHO细胞基因组中高表达位点的寻找和确认,建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统.