米曲霉(Aspergillus oryzae)果胶酸内切水解酶(PGA)在原核系统中重组表达

摘要

果胶酶具有广阔的商业用途,在食品工业上主要用于果汁和酒类的澄清、提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纤维脱胶.米曲霉(Aspergillus oryzae)一直用于传统发酵食品的生产,自然条件下其果胶酶的产量较低.文献报道的果胶酶的重组表达成功的例子较少,且活性较低.通过RT-PCR的方法,获得不合信号肽的果胶酸内切水解酶A(polygalacturonase A,PGA)的cDNA,PGA cDNA连入pET-28a(+)载体,构建pET-28a(+)-pga质粒.pET-28a(+)-pga转化Turner(DE3)placⅠ细胞,得到转化子pET-28a(+)-pga-Turner(DE3)placⅠ,首次实现了米曲霉PGA在大肠杆菌系统中过表达,进一步对PGA在大肠杆菌系统中表达的条件进行了研究.在37℃、220 r/min条件培养pET-28a(+)-pga-Turner(DE3)placⅠ细胞,OD600至0.8左右时,用500 μmol/L isopropyl β-D-thiogalactogalactopyranoside(IPTG)进行诱导表达,在15℃和170 r/min条件下继续培养24 h,表达效果最好,相对于每毫升培养基而言,产酶可达到70 u/mL,是米曲霉自然条件产酶量的87.5倍,远优于文献报道的重组表达的PGA酶活.